Республики Беларусь

Учреждение Образования

«Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия

ветеринарной медицины»

Кафедра микробиологии и вирусологии

Кафедра кормления с.-х. животных им. профессора Лемеша В.Ф.

МИКРОБИОЛОГИЯ РАСТИТЕЛЬНЫХ КОРМОВ

Учебно-методическое пособие к лабораторно- практическим занятиям по микробиологии для студентов специальности 2-740301 «Зоотехния», слушателей ФПК, специалистов кормопроизводства, аспирантов и преподавателей.

Гласкович Алефтина Абликасовна , кандидат вет. наук, доцент УО «ВГАВМ»

Вербицкий Анатолий Анатольевич , зав. кафедрой, кандидат вет. наук, доцент. УО «ВГАВМ»

Ганущенко Олег Федорович , кандидат с.-х. наук, доцент УО «ВГАВМ»

Рецензенты:

доктор вет. наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии

Медведев А.П .

кандидат с.х.н., доцент кафедры кормопроизводства Шагалеев Ф.Ф.

кандидат вет. наук, доцент, зав. кафедрой болезней мелких животных и птиц Зелютков Ю.Г.

Учебно-методическое пособие.

« 17 » октября 2003 г. (протокол № 1)

Разрешено к печати редакционно-издательским советом УО «ВГАВМ»

Введение

Консервирование кормов в настоящее время сопровождается большими потерями. Если силосование выполняется надлежащим образом, к примеру, в горизонтальных силосохранилищах потери составляют в среднем около 20%. При неквалифицированной работе они значительно возрастают. На основании многочисленных исследований можно констатировать, что величину потерь, вызванных деятельностью микроорганизмов кормов, часто недооценивают. При составлении кормового баланса предусматриваются только «неизбежные» потери в результате «угара». Однако, следует иметь в виду, что силос, находившийся под испорченным в результате вторичного брожения слоем (верхний и боковые слои), характеризуется высоким рН и непригоден для скармливания. Сенаж, подвернувшийся самосогреванию в результате аэробных процессов, теряет свое кормовое достоинство наполовину. Плесневелое сено, зерно, кислый силос является причиной многих болезний с.-х. животных.

Знание физиолого-биохимических особенностей отдельных групп микроорганизмов, встречающихся в консервированных кормах, и факторов, ограничивающих или стимулирующих их развитие необходимо для того, чтобы исключить ошибки при заготовке, хранении и скармливании консервированных кормов.

Учебно-методическое пособие рассчитано на 4 часа лекций и 22 часа лабораторно-практических занятий.

1. Краткая характеристика микроорганизмов кормов.

Эпифитная микрофлора, ее состав и особенности.

Эпифитная микрофлора – это микроорганизмы, встречающиеся на поверхности растущих растений. Ее количественный и качественный (видовой) состав сильно колеблется и зависит от времени года, местности, вида и стадии развития растений, степени их загрязненности и многих других условий. Так, на 1 г сырой массы приходилось следующее количество микроорганизмов: свежая лугопастбищная трава – 16000, люцерна – 1600000, кукуруза – 17260000.

В разнообразной микрофлоре содержится лишь сравнительно небольшое количество молочнокислых бактерий (таблица 1).

Таблица 1

Количественный и качественный состав микроорганизмов, клеток/ г

В 1 г люцерны насчитывалось около 1,6 млн. микроорганизмов, но среди них было только 10 молочнокислых бактерий. Следовательно, на 1 желательный микроорганизм приходилось 160000 нежелательных. Исключение составляет кукуруза. На 1 г свежей массы этого растения приходилось более 100000 молочнокислых бактерий. По-видимому, хорошая силосуемость кукурузы объясняется как благоприятным соотношением питательных веществ, так и большей численностью молочнокислых бактерий. Этими же факторами обуславливается хорошая силосуемость также других кормов с повышенным содержанием сахаров (свекловичная ботва, просо и др.).

Таким образом, на растениях находится огромное количество разнообразных микроорганизмов, однако это количество незначительно по сравнению с плотностью микроорганизмов после закладки и хранении в том или ином хранилище.

Микробиологические процессы, происходящие при силосовании.

Количественный и качественный (видовой) состав сообщества микроорганизмов, участвующих в созревании силоса, также зависит от ботанического состава зеленой массы, содержания в ней растворимых углеводов и протеина, влажности исходной массы. Так, например, сырье богатое белками (клевер, люцерна, донник, эспарцет) в отличие от сырья, богатого углеводами (кукуруза, просо и др.), силосуется при длительном участии в процессах гнилостных бактерий и при замедленном нарастании численности молочнокислых бактерий.

Однако, в любом случае после закладки растительной массы в хранилище наблюдается массовое размножение микроорганизмов. Их общее количество уже через 2-9 суток может значительно превышать количество микроорганизмов, попадающих с растительной массой (таблица 2).

При всех способах силосования в созревании силосов участвует сообщество микроорганизмов, состоящее из двух диаметрально противоположных групп по характеру воздействия на растительный материал: вредные (нежелательные) и полезные (желательные) группы . Характер их взаимоотношений варьирует не только от симбиотических до антагонистических, обуславливающих в конечном итоге успех или неудачу в исходе силосования, но и от природы силосуемого материала, воздушного и температурного режима .

Таблица 2

Динамика развития молочнокислых и гнилостных микроорганизмов при силосовании кукурузы и клевера.

Анализируемый материал	Количество микроорганизмов (млн. на 1 г силосуемой массы)
	Молочнокислые	Гнилостные
Исходная масса кукурузы с початками
Силос: 2-суточный
7-суточный
15-суточный
Исходная масса клевера
Силос: 5-суточный
9-суточный
30-суточный

Таким образом, в процессе силосования происходит замена гнилостных микроорганизмов молочнокислыми, которые вследствие образования молочной и частично уксусной кислот снижают рН корма до 4,0-4,2 и тем самым создают неблагоприятные условия для развития гнилостных микроорганизмов (табл.2).

Условия для существования (потребность в кислороде, отношение к температуре, активной кислотности и т.д.) для различных групп микроорганизмов неодинаковые. С точки зрения потребности в кислороде различают условно три группы микроорганизмов:

размножающиеся только при полном отсутствии кислорода (облигатные анаэробы);

размножающиеся только при наличии кислорода (облигатные аэробы);

размножающиеся как при наличии кислорода, так и без него (факультативные анаэробы).

Большинство микроорганизмов, которые вызывают порочное брожение, не выдерживают рН ниже 4,0, поэтому желательно быстро достичь этого оптимального уровня кислотности.

Чтобы ограничить деятельность вредных микроорганизмов и стимулировать размножение полезных бактерий следует знать особенности отдельных групп микроорганизмов. В таблице 3 схематично представлены физиолого-биохимические особенности основных представителей микроорганизмов, участвующих в процессах силосования.

1.2.1. Молочнокислые бактерии.

Среди разнообразной эпифитной микрофлоры растений содержится лишь сравнительно небольшое количество неспорообразующих факультативных анаэробов, гомо, - гетероферментативных молочнокислых бактерий. Их численность при благоприятных условиях силосования быстро достигает 10 4 -10 8 , а иногда – 10 9 , а оптимальным количеством считают 10 5 -10 7 клеток/г сырого материала.

Основным свойством молочнокислых бактерий, по которым их объединяют в отдельную обширную группу микроорганизмов, является способность образовывать в качестве продукта брожения молочную кислоту:

С 6 Н 12 О 6 ═ 2С 3 Н 6 О 3 .

глюкоза молочная кислота

Она создает в среде активную кислотность (рН 4,2 и ниже), неблагоприятно действующую на нежелательные микроорганизмы. Помимо этого, значение молочнокислых бактерий заключается в бактерицидном действии недиссоциированной молекулы молочной кислоты и способности их образовывать специфические антибиотические и др. биологически активные вещества.

В процессе брожения, протекающем в обычных благоприятных условиях, гомоферментативные молочнокислые бактерии (Streptococcus sp., Pediococcus sp., Lactobacterium plantarum и др.) образуют из глюкозы (гексозы) преимущественно молочную кислоту по гликолитическому пути Эмбдена-Мейергофа-Парнаса. Выход молочной кислоты составляет 95-97%. Одновременно образуются следовые количества летучих кислот, этилового спирта, фумаровой кислоты и углекислоты. Из субстрата извлекается значительно меньше энергии, чем при других (аэробных) процессах энергетического обмена. Тем не менее этот путь энергетических превращений при достаточном уровне углеводов обеспечивает быстрое развитие культур. Кроме глюкозы субстратом для гомофермантативного молочнокислого брожения могут служить другие гексозы (фруктоза, манноза, галактоза), пентозы (ксилоза, арабиноза), дисахариды (лактоза, мальтоза, сахароза) и полисахариды (декстрины). Негидролизованный крахмал не доступен для большинства молочнокислых бактерий. В растениях при сбраживании пентоз (сахаров с пять атомами углерода) молочнокислыми бактериями кроме молочной образуется и уксусная кислота:

6С 5 Н 10 О 5 ═ 8 С 3 Н 6 О 3 + 3С 2 Н 4 О 2

пентоза молочная кислота уксусная кислота

Уксуснокислые бактерии являются ацидофилами, то есть переносят кислую среду. Но так как они являются аэробами, поэтому в хорошо уплотненной массе они не способны развиваться.

Гетероферментативные формы (Leuconostoc sp., Lactobacillus sp.) сбраживают углеводы пентозофосфатным путем. Они менее желательны в силосе, так как кроме молочной кислоты образуют значительное количество побочных продуктов распада углеводов (этиловый спирт, уксусная кислота, углекислый газ, глицерин и др.), используя на это до 50% сбраживаемых углеводов (гексозы, пентозы). Судя по интенсивности роста гетероферментативных бактерий, выход энергии на 1 моль глюкозы оказывается на одну треть ниже, чем у гомоферментативных молочнокислых бактерий.

Таблица 3

Условия существования микроорганизмов в силосе

Микроорганизмы	Разлагают			Потребность в кислороде
	углеводы		молочную кислоту
Молочнокислые	До молочной кислоты и некоторых побочных продуктов			Факультативные анаэробы
Маслянокислые (клостридии)	До масляной кислоты и СО 2	До аминокислот, аминов, аммиака	До масляной кислоты, СО 2 и Н 2	Облигатные анаэробы
Гнилостные (бациллы)	До газов	До аминов, аммиака	До газов	Облигатные аэробы
Грибы: плесневые	До СО 2 и Н 2 О	До аминнов, аммиака	До СО 2 и Н 2 О	Облигатные аэробы
	До спирта и СО 2	До аминнов, аммиака	До спирта	Факультативные анаэробы

Продолжение таблицы 3

Требования		Образуют споры	Влияние на качество силоса и молочные продукты
кислотности, рН	температуры, С 0
Оптимальная Минимальная			Желательны: молочная кислота – консервирующий фактор, образуют др. биологически активные вещества
			Вредны: разлагают углеводы, молочную кислоту и белок, «вспучивают» сыры
		(но не все виды)	Вредны: разлагают углеводы, белок, молочную кислоту, с образованием токсичных аминов
			Вредны: образуют токсины, в крайних случаях делают корм непригодным
			Вредны: возбудители вторичных процессов брожения

Существует целый ряд причин, в силу которых молочнокислые бактерии не занимают доминирующего положения. Существенным фактором, лимитирующим размножение молочнокислых бактерий, является низкое содержание легкосбраживаемых углеводов (моно- и дисахаридов) в исходной траве. Повышенные требования молочнокислых бактерий распространяются не только на определенные углеводы, но и на аминокислоты, витамины. Даже при незначительном недостатке этих веществ, несмотря на прочие оптимальные условия (отсутствие кислорода, оптимальная температура), молочнокислые бактерии не всегда размножаются.

Температурный фактор влияет как на рост молочнокислых бактерий, так и на характер конечных продуктов брожения. Педиококки, преобладающая форма молочнокислых бактерий в первые дни созревания силоса, хорошо растут при 45 0 С. Оптимальной температурой роста палочковидных форм молочнокислых бактерий (L. plantarum, L. brevis), которые приходят на смену коккам, является 30-35 0 С. При температуре выше 40 0 С их количество резко падает, угнетается кислотообразование в 1,3-3 раза. Установлено, что наибольший выход молочной кислоты и наименьший – уксусной наблюдается при температуре ниже 30 0 С.

Для получения качественного силоса не меньшее значение имеет создание анаэробных условий – плотная трамбовка и хорошая герметизация. В силосе, полученном в негерметичных условиях (аэробных), количество молочнокислых бактерий после начального увеличения быстро падает, в герметичных (анаэробных) – оно остается высоким. На седьмые сутки брожения при анаэробных условиях наблюдается высокий процент гомоферментативных бактерий, в аэробных – педиококков. Хотя позднее в этом силосе и появляется достаточное количество молочнокислых палочек, но они уже не могут предотвратить размножение нежелательных микроорганизмов.

Таким образом, молочнокислые бактерии отличаются следующими особенностями, важными для силосования:

Нуждаются для обмена веществ, главным образом, в углеводах (сахар, реже крахмал);

Белок не разлагают (некоторые виды в ничтожном количестве);

Они факультативные анаэробы, т.е. развиваются без кислорода и при наличии кислорода;

Температурный оптимум чаще всего составляет 30 0 С (мезофильные молочнокислые бактерии), но у некоторых форм он достигает 60 0 С (термофильные молочнокислые бактерии);

Выдерживают кислотность до рН 3,0;

Могут размножаться в силосе с очень высоким содержанием сухого вещества;

Легко переносят высокие концентрации NаCl и обладают устойчивостью к некоторым другим химическим препаратам;

Помимо молочной кислоты, которая играет решающую роль в подавлении нежелательных типов брожения, молочнокислые бактерии выделяют биологически активные вещества (витамины группы В и др.). Они обладают профилактическими (или лечебными) свойствами, стимулируют рост и развитие с.-х. животных.

При благоприятных условиях (достаточное содержание в исходном растительном материале водорастворимых углеводов, анаробиоз) молочнокислое брожение заканчивается всего за несколько дней и рН достигает оптимального значения – 4,0-4,2.

1.2.2. Маслянокислые бактерии.

Маслянокислые бактерии (Clostridium sp.) - спорообразующие, подвижные, палочковидные анаэробные маслянокислые бактерии (клостридии) широко распространены в почве. Присутствие клостридий в силосе является результатом загрязнения почвой, поскольку их численность на зеленой массе кормовых культур, как правило, очень низка. Почти сразу же после заполнения хранилища зеленой массой маслянокислые бактерии начинают интенсивно размножаться вместе с молочнокислыми в первые несколько дней.

Высокая влажность растений, обуславливающаяся наличием в измельченной силосной массе клеточного сока растений и анаэробные условия в силосохранилище – идеальные условия для роста клостридий. Поэтому уже к концу первых суток их численность возрастает и в дальнейшем зависит от интенсивности молочнокислого брожения. В случае слабого накопления молочной кислоты и снижения рН маслянокислые бактерии энергично размножаются и число их достигает максимума (10 3 -10 7 клеток/г) в несколько суток.

По мере увеличения влажности (при содержании в силосной массе 15% сухого вещества) чувствительность клостридий к кислотности среды снижается даже при рН 4,0 (4)

Трудно указать точное критическое значение рН силоса, при котором начинается ингибирование клостридий, так как оно зависит не только от количества образованной молочной кислоты, но также от воды в корме и температуры среды.

Клостридии чувствительны к недостатку воды. Доказано, что с увеличением свободной воды чувствительность этих бактерий к кислотности среды снижается.

Температура корма оказывает заметное влияние на рост клостридий. Оптимальная температура для роста большинства этих бактерий около 37 0 С. Высокой термоустойчивостью характеризуются споры клостридий. Поэтому маслянокислые бактерии могут долгое время сохраняться в силосе в виде спор и при попадании в благопринятные условия для их развития начинают размножаться. Этим объясняется расхождение в биохимических и микробиологических показателях силоса: масляная кислота отсутствует, а титр маслянокислых бактерий в этих же образцах корма высокий.

Изучение в силосе продуктов маслянокислого брожения показало, что встречаются две физиологические группы: сахаролитические и протеолитические.

Сахаролитические клостридии (Cl.butyricum, Cl.pasteurianum) сбраживают главным образом моно- и дисахариды. Количество образовавшихся продуктов разнообразно (масляная, уксусная, муравьиная кислоты, бутиловый, этиловый, амиловый и пропиловый спирты, ацетон, водород и углекислота) и сильно колеблется. Это обусловлено видовой принадлежностью микроорганизмов, субстратом, рН, температурой. Отношение углекислоты и водорода обычно 1:1. Предполагается, что масляная кислота возникает в результате конденсации двух молекул уксусной кислоты. Непосредственное образование масляной кислоты не может служить источником энергии для клостридий. Для поддержания их жизнедеятельности необходима уксусная кислота, которая образуется при окислении уксусного альдегида в результате декарбоксилирования пировиноградной или молочной кислоты.

К сахаролитическим клостридиям, сбраживающим молочную кислоту и сахар, относят Cl. butyricum, Cl.tyrobutyricum, Cl.papaputrificum. В силосе с преобладанием этих клостридий обычно почти не обнаруживают молочную кислоту и сахар. В основном присутствует масляная, хотя нередко может быть много уксусной кислоты.

С 6 Н 12 О 6 = С 4 Н 8 О 2 +2СО 2 +2Н 2

сахар масляная углекис- водород

кислота лый газ

2С 3 Н 6 О 3 = С 4 Н 8 О 2 +2СО 2 +2Н 2

молочная масляная углекис- водород

кислота кислота лый газ

Протеолитические клостридии сбраживают, главным образом, белки, а также аминокислоты и амиды. В результате катаболизма аминокислот образуются летучие жирные кислоты, среди которых преобладает уксусная. Выявлено значительное участие протеолитических клостридий в разложении и углеводов. В силосах встречаются протеолитические клостридии видов Cl.sporogenes, Cl.acetobutyricum, Cl.subterminale, Cl.bifermentas. Количество масляной кислоты в силосе – надежный показатель масштабов деятельности клостридий.

Маслянокислое брожение приводит к высоким потерям питательных веществ в результате катаболизма белков, углеводов и энергии. Энергии теряется в 7-8 раз больше, чем при молочнокислом. Кроме того, происходит смещение реакции силоса в нейтральную сторону из-за образования щелочных соединений при расщеплении белка и молочной кислоты. Органолептические показатели корма ухудшаются вследствие накопления масляной кислоты, аммиака и сероводорода. При кормлении коров таким силосом споры клостридий с молоком попадают в сыр и, прорастая в нем при определенных условиях, могут быть причиной его «вспучивания» и прогоркания.

Таким образом, для возбудителей маслянокислого брожения характерны следующие основные физиолого-биохимические особенности:

Маслянокислые бактерии, являясь облигатными анаэробами, начинают развиваться в условиях сильного уплотнения силосной массы;

Разлагая сахар, они конкурируют с молочнокислыми бактериями, а используя белки и молочную кислоту, приводят к образованию сильнощелочных продуктов распада белка (аммиака) и токсичных аминов;

Маслянокислые бактерии нуждаются для своего развития во влажном растительном сырье и при высокой влажности исходной массы имеют наибольшие шансы подавить все остальные типы брожения;

Оптимальные температуры для маслянокислых бактерий колеблются от 35-40 0 С, но их споры переносят более высокие температуры;

Чувствительны к кислотности и прекращают свою деятельность при рН ниже 4,2.

Эффективными мерами против возбудителей маслянокислого брожения являются – быстрое подкисление растительной массы, подвяливание влажных растений. Существуют биопрепараты на основе молочнокислых бактерий для активации молочнокислого брожения в силосе. Кроме того, разработаны химические вещества, которые оказывают бактерицидное (подавляющее) и бактериостатическое (тормозящее) действие на маслянокислые бактерии.

1.2.3. Гнилостные бактерии (Bacillus, Pseudomonas).

Представители рода бацилл (Bac.mesentericus, Вac.megatherium) сходны по своим физиолого-биохимическим особенностям с представителями клостридий, но в отличие от них способны развиваться в аэробных условиях. Поэтому они одними из первых включаются в процесс ферментации и чаще всего встречаются в количестве 10 4 -10 6 , но в некоторых случаях (нарушения технологии) – до 10 8 -10 9 . Эти микроорганизмы являются активными продуцентами разнообразных гидролитических ферментов. Они используют в качестве питательных веществ различные белки, углеводы (глюкозу, сахарозу, мальтозу и др.) и органические кислоты. Значительная часть белкового азота (до 40% и более) под действием бацилл может быть переведена в аминную и аммиачную форму, а часть аминокислот в моно- и диамины, особенно в условиях медленного подкисления массы. Декарбоксилирование имеет свой максимум в кислой среде, тогда как дезаминирование происходит в нейтральной и щелочной. При декарбоксилировании могут возникать амины. Некоторые из них обладают токсическими свойствами (индол, скатол, метилмеркаптан и др.) и при скармливании силоса эти вещества поступая в кровь, вызывают различные заболевания и отравления животных. Некоторые виды бацилл сбраживают глюкозу, образуя 2, 3-бутиленгликоль, уксусную кислоту, этиловый спирт, глицерин, углекислоту и в следовых количествах муравьиную и янтарную кислоты.

Важным свойством гнилостных бактерий, которое имеет значение для протекающих в кормовой массе процессов, является их способность к спорообразованию. В некоторых разложившихся силосах, особенно кукурузном, были обнаружены бактерии, относящиеся к видам Bacillus. Они, видимо, свойственны силосу, а не привнесены извне (с воздухом). Из многих силосов после их длительного хранения выделяются бациллы, хотя в исходной траве они почти не обнаруживаются. Исходя из этого, было высказано предположение, что некоторые гнилостные бактерии могут в анаэробных условиях развиваться из спор.

Таким образом, исходя из вышесказанного основными особенностями для возбудителей гнилостного брожения являются следующие:

Они не могут существовать без кислорода, поэтому в герметичном хранилище гниение невозможно;

Гнилостные бактерии разлагают прежде всего белок (до аммиака и токсичных аминов), а также углеводы и молочную кислоту (до газообразных продуктов);

Гнилостные бактерии размножаются при рН выше 5,5. При медленном подкислении корма значительная часть белкового азота переходит в аминную и аммиачную формы;

Важным свойством гнилостных бактерий является их способность к спорообразованию. В случае длительного хранения и скармливания силоса, в котором дрожжи и маслянокислые бактерии разложат большую часть молочной кислоты или она будет нейтрализована продуктами разложения белка, гнилостные бактерии, развиваясь из спор, могут начать свою разрушительную деятельность.

Главным условием ограничения существования гнилостных бактерий является быстрое заполнение, хорошая трамбовка, надежная герметизация силосохранилища. Потери, вызываемые возбудителями гнилостного брожения, можно снизить при помощи химических консервантов и биопрепаратов.

1.2.4. Плесневые грибы и дрожжи.

Оба эти типа микроорганизмов относятся к грибам и являются весьма нежелательными представителями микрофлоры силоса. Как следует из таблицы 3, они легко переносят кислую реакцию среды (рН 3,2 и ниже). Поскольку плесневые грибы (Penicillium, Aspergillus и др.) являются облигатными аэробами, то они начинают развиваться сразу после заполнения хранилища, но с исчезновением кислорода развитие их прекращается. В правильно заполненном силосохранилище с достаточной степенью уплотнения и герметизацией это происходит уже через несколько часов. Если в силосе есть очаги плесени, значит вытеснение воздуха было недостаточным или герметизация была неполной. Опасность плесневения особенно велика в силосе из подвяленного материала, т.к. такой корм, особенно его верхние слои очень трудно уплотнить. В наземных буртах надежная герметизация практически недостижима. Почти 40% силоса заплесневает; корм имеет разложившуюся, мажущуюся структуру и становится непригодным к скармливанию.

Дрожжи (Hansenula, Pichia, Candida, Saccharomyces, Тorulopsis) развиваются непосредственно после заполнения хранилищ, т.к. они являются факультативными анаэробами и могут развиваться при незначительных количествах кислорода в силосе. Кроме того они обладают высокой устойчивостью к температурному фактору и низкому рН.

Дрожжевые грибы прекращают свое развитие только при полном отсутствии кислорода в силосохранилище, но небольшие их количества обнаруживаются в поверхностных слоях силоса.

В анаэробных условиях они используют простые сахара (глюкозу, фруктозу, маннозу, сахарозу, галактозу, рафинозу, мальтозу, декстрины) по гликолитическому пути и развиваются за счет окисления сахаров и органических кислот:

С 6 Н 12 О 6 = 2С 2 Н 5 ОН+2СО 2 +0,12 МДж

сахар спирт углекислый газ

Полное использование последних приводит к тому, что кислая среда силоса сменяется щелочной, создаются благоприятные условия для развития маслянокислой и гнилостной микрофлоры.

При спиртовом брожении наблюдаются большие потери энергии. Если при молочнокислом брожении теряется 3% энергии сахара, то при спиртовом – более половины. В аэробных условиях окисление углеводов дрожжами приводит к получению воды и СО 2 . Некоторые дрожжи используют пентозы (Д-ксилозу, Д-рибозу), полисахариды (крахмал).

Негативное действие дрожжей в процессах вторичного брожения состоит в том, что они развиваются за счет окисления органических кислот, наступающего после законченного брожения при доступе воздуха. В результате окисления молочной и др. органических кислот кислая реакция среды сменяется на щелочную – до рН-10,0.

В результате этого снижается качество силоса из кукурузы, а также из «глубоко» провяленных трав, т.е. кормов с наилучшими показателями по продуктам брожения.

Таким образом, для плесневых грибов и дрожжей свойственно:

Плесневые грибы и дрожжи относятся к нежелательным представителям аэробной микрофлоры;

Негативное действие плесневых грибов и дрожжей в том, что они вызывают окислительный распад углеводов, белков и органических кислот (в т.ч. молочной);

Легко переносят кислую реакцию среды (рН ниже 3,0 и даже 1,2);

Плесневые грибы выделяют опасные для здоровья животных и людей токсины;

Дрожжи, являясь возбудителями вторичных процессов брожения, приводят к аэробной нестабильности силосов.

Ограничение доступа воздуха путем быстрой закладки, трамбовки и герметизации, правильная выемка и скармливание – решающие факторы, ограничивающие развитие плесневых грибов и дрожжей. Для подавления развития возбудителей вторичного брожения рекомендованы препараты с фунгистатической (фунгицидной) активностью (приложение 2).

Обобщая вышеизложенное, микроорганизмы в силосе можно разделить на полезные (молочнокислые бактерии) и вредные (маслянокислые, гнилостные бактерии, дрожжи и плесневые грибы).

Исходя из физиолого-биохимических особенностей микроорганизмов, встречающихся в силосе, быстрое снижение рН (до 4,0 и менее) тормозит размножение многих нежелательных микроорганизмов. В таком интервале рН наряду с молочнокислыми могут существовать только плесневые грибы и дрожжи. Но для них требуется кислород. Поэтому для успешного силосования необходимо как можно быстрее удалить воздух из хранилища за счет надежной трамбовки и быстрого заполнения хранилища, надлежащего укрытия. Этим самым обеспечиваются благоприятные условия для молочнокислых бактерий (анаэробов).

В идеальном случае, а именно, при достаточном содержании в исходном растительном материале водорастворимых углеводов и анаэробных условиях молочнокислое брожение занимает доминирующее положение. Всего за несколько дней рН достигает своего оптимального уровня, при котором прекращаются нежелательные типы брожения. При силосовании богатых протеином кормовых растений необходимо их провяливать или использовать химические и биологические консерванты, которые подавляют (ингибируют) развитие нежелательных микроорганизмов и позволяют получить доброкачественный корм независимо от силосуемости и влажности исходного сырья.

Микробиологические процессы, происходящие при созревании сенажа.

Принято считать, что основное сообщество микроорганизмов, которое выявляется в процессе созревания сенажа представлено так же как и в силосе тремя основными физиологическими группами (молочнокислыми, гнилостными бактериями и дрожжами), но в меньшем количестве. Максимальное количество микроорганизмов в подвяленном материале выявляется до 15 суток (в силосе до 7). В сенаже меньше органических кислот, больше сахара, а его кислотность, как правило, ниже кислотности силоса.

Биологической основой приготовления сенажа является ограничение остаточного дыхания растительных клеток и нежелательных микроорганизмов путем «физиологической сухости». Водоудерживающая сила в сенаже равна примерно 50 атм., а осмотическое давление у большинства бактерий составляет 50-52 атм., т.е. при влажности травы 40-55% вода находится в малодоступной для большинства бактерий форме. Благодаря повышенному осмотическому давлению в сенажной массе маслянокислые бактерии и их споры не могут использовать влагу корма для своего развития и прорастания. Плесени могут развиваться с указанной влажностью, но их существование затруднено из-за отсутствия воздуха (кислорода).

Осмотолерантные виды молочнокислых бактерий могут развиваться при такой влажности. У культур молочнокислых бактерий сенажа осмотическая активность, активность размножения, накопление молочной кислоты, а также способность сбраживать сложные углеводы (крахмал и др.) выше, чем у культур молочнокислых бактерий силоса. . Поэтому как и при силосовании должны создаваться оптимальные условия для развития молочнокислых бактерий (непрерывное уплотнение во время закладки и герметичное укрытие полиэтиленовой пленкой для ограничения доступа воздуха). Если же хранилище недостаточно уплотнено и негерметично это приводит к разогреванию, плесневению корма и другим нежелательным аэробным процессам. В таких условиях сенаж хорошего качества приготовить нельзя. В результате процессов самосогревания резко снижаются переваримость питательных веществ, особенно протеина. Технология заготовки сенажа и силоса из трав с пониженной влажностью детально изложены во многих книгах и руководствах, мы лишь подчеркнем здесь, что при соблюдении основных технологических приемов питательность сенажа выше питательности силоса, приготовленного из корма естественной или пониженной влажности. В 1 кг натурального корма содержится 0,30-0,35 корм.ед.

Микрофлора сена и влажного зерна.

Теоретически приготовление сена связано с высушиванием культуры с первоначального содержания воды 65-75% до ее содержания 10-16%, при котором прекращается вся биохимическая и микробиологическая деятельность. На практике сено не высушивается до такого низкого содержания воды и фактически считают безопасным хранить сено после того, как среднее содержание воды в нем снизилось до 20%. Это достаточно высокая влажность, при которой происходит плесневение, если только при хранении не происходит дальнейшей потери воды.

Во всех случаях в первые 2-3 дня хранения наблюдается первый пик температуры и за ним резко следует второй, более высокий пик. Именно второй пик обусловлен дыханием быстро развивающихся грибов. Чем выше содержание воды уровня 20%, тем сильнее возрастает опасность плесневения, увеличения потерь сухого вещества. Так, если рыхлые кипы сена хранятся при содержании воды 35-40%, потери сухого вещества будут около 15-20%, а растворимых углеводов – будут полными. Микробиологический анализ выявит большую численность микроорганизмов, включающих опасные термофильные актиномицеты (раздел 2.3.).

Термин «влажное зерно», как правило, применяется к зерну с влажностью от 18 до 20%. Влажное зерно начинает согреваться уже через несколько часов после уборки в основном за счет микроорганизмов. Если условия хранения неподходящие и не контролируются, температура зерна будет повышаться до уровня, при котором могут успешно расти очень опасные актиномицеты, которые вызывают целый ряд различных заболеваний животных и людей (раздел 2.1.3.). Если зерно содержит более 18% воды имеют место вторичные изменения, которые обусловлены дрожжами, относящимся к родам Candida и Hansenula. Эти микроорганизмы способны расти при очень низком содержании кислорода и в этих условиях может происходить слабое спиртовое брожение. Такого рода брожение приводит к снижению содержания сахарозы и увеличению содержания восстанавливающих сахаров, образованию различных привкусов, повреждению клейковины.

2. Масштабы потерь в консервированных кормах, вызванные деятельностью микроорганизмов.

При составлении баланса кормов нужно учитывать потери при заготовке и хранении консервированных кормов. Существует много схем, показывающих, что общие потери складываются из потерь в поле, хранилищах и происходят еще во время уборки зеленой массы. В данном руководстве рассматривается величина потерь, вызванных деятельностью микроорганизмов, которые зачастую недооцениваются и при неквалифицированной работе могут достигать огромных размеров.

2.1. Потери при брожении .

После отмирания растительных клеток в заполненном и хорошо уплотненном хранилище начинается интенсивное разложение и преобразование питательных веществ размножающимися микроорганизмами. Происходят потери в результате образования бродильных газов («угар»), потерь в верхних и боковых слоях, потерь из-за вторичных процессов брожения.

Непрерывное заполнение хранилищ (силосного, сенажного) позволяет значительно снизить образование газов. При быстром заполнении хранилища потери сухого вещества вследствие «угара» могут составлять 5-9%. При растянутом заполнении соответствующие показатели могут достигать 10-13% и более. Следовательно, путем непрерывного заполнения можно сократить потери от «угара» примерно на 4-5%. Следует учитывать, что в плохо уплотненном сенаже в результате процессов самосогревания происходит снижение переваримости протеина в два раза (раздел 1.3).

Интенсивное разложение питательных веществ происходит в верхних и боковых слоях в неукрытой силосной (сенажной) массы. При укрытии одной мякиной или без укрытия потери могут быть гораздо больше. Плесневые грибы развиваясь кладут начало сильному разложению белка. Продукты распада белка имеют щелочную реакцию и связывают молочную кислоту. Происходит также прямое разложение молочной кислоты. Перечисленные процессы ведут к повышению рН и ухудшению качества корма. Даже если в момент открытия хранилища толщина испорченного слоя не превышает 10 см, надо иметь в виду, что этот слой первоначально имел толщину 20-50 см, а силос, находящийся под испорченным слоем, характеризуется высоким рН, содержит ядовитые токсины и непригоден для скармливания.

Потери, вызванные вторичными процессами брожения могут достигать 20-25%. Установлено, что первую стадию порчи силоса вызывают именно дрожжи совместно с аэробными бактериями, связанную с его разогреванием, снижением кислотности. При второй стадии порчи силоса происходит последующее заражение плесенью. Такой корм считается непригодным в том случае, если в нем содержится более 5.10 5 грибов. Уже после 5-дневного аэробного хранения в случае длительного скармливания или неправильной выемки из хранилища кукурузный силос даже с хорошим начальным рН 4,1, но уже имеющим 3.10 7 дрожжей имеет астрономически высокое число дрожжей и плесеней Streptomycetcn.

2.2. Влияние кислого силоса на обмен веществ животных и качество молочных продуктов .

С силосом за сутки в организм животного вводится 0,7-0,9 кг органических кислот, которые оказывают существенное влияние на процессы пищеварения и обмен веществ. Скармливание перекисшего (кукурузного) силоса может привести к нарушению уровня сахара, щелочного резерва в крови, развитию кетозов. При этом кетонемия в организме высокопродуктивных коров развивается быстрее, чем у низкопродуктивных.

Длительное скармливание коровам по 25-30 кг в сутки силоса спонтанного брожения отрицательно отражается на воспроизводительной способности коров, биологической полноценности молозива и молока, что ведет к снижению роста телят и их сопротивляемости к желудочно-кишечным заболеваниям.

Если силос перекислен, он оказывает отрицательное влияние на вкусовые и технологические качества молока при его переработке в масло и сыры, ухудшает качество сливочного масла.

В настоящее время разработаны способы анаэробного раскисления перекисающих силосов из кукурузы с помощью заквасок на основе пропионовокислых бактерий и химических препаратов (углеаммонийные соли).

2.3. Кормовые токсикозы.

Известно, что животные поедают плесневое сено крайне неохотно или вовсе не едят его. Непригоден в качестве корма также плесневелый силос и сенаж. Ядовитые токсины, выделяемые некоторыми культурами грибов, обнаруживаются в силосе из наземных буртов и земляных силосохранилищах или в верхних слоях кормовой массы крупных силосных траншей при плохом уплотнении и негерметичном укрытии свежескошенной и особенно подвяленной массы. Имеются весомые медицинские свидетельства о том, что отмечаются легочные заболевания животных и работников, имеющих дело с плесневелым сеном и зерном. И у людей и животных они вызываются вдыханием термофильных микроорганизмов (Micropolispora, Тhermoactinomyces, Aspergillus).

Имеются многие другие потенциально опасные плесени, способные вызывать целый ряд микотоксикозов, в т.ч. снижение плодовитости, абортирование и общее ухудшение здоровья. Все эти заболевания вызываются микотоксинами, вырабатываемыми грибами Aspergillus, Fusarium, Penicillium (афлатоксины, цераленон, охратоксин).

3. Микробиологический анализ кормов.

Бактерии и грибы играют большую роль в консервировании кормовых растений, участвуя не только в процессах приготовления силоса, сенажа, но вызывая ферментацию влажного зерна, сена в стогах. Общее положительное влияние активности молочнокислых бактерий выражается, прежде всего, в разложении сложных органических веществ на более простые формы и образовании чаще всего органических кислот и витаминов. Однако, при неблагоприятных условиях консервирования (нарушении основных технологических приемов и т. д.) могут иметь место отрицательные последствия по причине нежелательных процессов. Хороший силос, сенаж и сено, к примеру, должны быть свободны от плесневого мицелия и плесневого запаха. Появление плесени при органолептической оценке служит признаком плохого качества растительных кормов, так как представляет угрозу для здоровья животных, людей. Такой корм должен выбраковываться или подвергаться ветеринарно-токсикологическому исследованию.

Насколько важна микробиологическая оценка качества корма наряду с биохимическими анализами очевидно со следующего примера. При созревании сыра обнаруживалось нежелательное “вспучивание” из-за образования газов, несмотря на то, что в скармливаемом коровами силосе масляная кислота отсутствовала. В результате микробиологического анализа был выявлен высокий титр маслянокислых бактерий, которые долгое время сохранялись в силосе в виде спор и лишь попав в благоприятные условия они развивались из спор. Силос, содержащий споры масляно-кислых бактерий, способствовал бактериальному заражению молока. Такое молоко характеризовалось плохой устойчивостью При хранении было совершенно непригодно для приготовления сыров. Поэтому иногда в некоторых сыродельческих районах ошибочно считают скармливание силоса нецелесообразным. Благодаря применению микробиологического анализа в сочетании с образцовой дезинфекцией доильных установок достигается улучшение качества молока.

3.1. Основные микробиологические методы определения качества кормов.

1. Подготовка исследуемого материала (суспензии корма)к анализу.

Среднюю пробу (весом 0,5-1,0 кг) исследуемого материала (силоса или сенажа) тщательно перемешивают (с соблюдением основных правил асептики) и измельчают на кусочки длиной 1-2 см. Затем навеску (50 г) хорошо перемешанной средней пробы помещают в стерильный гомогенизатор марки М.S.E. Ato-mix, добавляют 450 мл стерильной водопроводной воды и в течение 1 минуты гомогенизируют. Полученную суспензию разбавляют до 10 5 -10 6 раз стерильной водопроводной водой (5 мл суспензии + 45 мл воды), взбалтывают каждое разведение в течение 5 минут.

2. Высев суспензии на элективные среды (приложение 1) проводят по 1 мл суспензии – при глубинном посеве, по 0,05-0,1 мл суспензии при посеве в жидкие среды.

3. Определение количества молочнокислых бактерий проводят на капустном агаре с мелом (среда 1) и на капустном агаре со спиртом и мелом (среда 2) – глубинный посев.

Подсчет колоний молочнокислых бактерий на капустном агаре с мелом проводят на 5-6 день, а на капустном агаре со спиртом и мелом – на 7-10 день (при 28 0).

4. Количество посторонней микрофлоры (аэробных гнилостных микроорганизмов ) определяют глубинным посевом на пептонном агаре (среда 3). Подсчет колоний ведется на 5-7 день при 28 0 .

5. Колиство спор аэробных гнилостных бацилл на специальной среде (мясопептонный агар + сусло-агар) – среда 8. Посев поверхностный (0,05мл), подсчет колоний ведут на 4 день (при 28 0).

6.Количество микроскопических грибов и дрожжей определяют на сусло-агаре со стрептомицином (среда 4) поверхностным посевом (0,1 мл). Подсчет колоний ведут на 3-4 день (при необходимости повторно на 7-8 день) при 28 0 .

7. Титр маслянокислых бактерий устанавливают на жидкой картофельной среде (среда 5). Для определения количества спор маслянокислых бактерий проводят посев из суспензии после пастеризации в течение 10 минут при 75 0 .

Учет результатов анализа ведут по интенсивности и выделения газа (кусочки картофеля всплывают на поверхность жидкости), титр маслянокислых бактерий и их спор устанавливают по методу предельных разведений.

8. Анаэробные протеолитические бактерии определяют на мясо-пептонном бульоне (среда 6) по выделению газа в поплавках. Посевы выдерживаются при 28 0 в течение двух недель.

9. Денитрифицирующие бактерии учитывают на среде Гильтая (среда 7) при анализе корма из трав, выращенных по фону высоких доз азотных удобрений. Подсчет ведется по интенсивности выделения газа и посевы выдерживают в течение 10-12 дней при 28 0 .

10. Тест микробиологического роста.

Для определения фунгистатических (фунгицидных), бактериостатических (бактерицидных) свойств соединений две пробирки (в трех повторностях) с элективной средой, в одной из которых добавлен изучаемый препарат, засевается тест-культурой. Из пробирки с культурой, где после добавления того или иного ингибирующего препарата не наблюдалось роста, переносится петля на свежую среду (не содержащую препарата). Если через 24 часа начинается усиленный рост, изучаемый препарат обладает фунгистатическим, бактериостатическим (тормозящим) действием. Если через неделю роста не наблюдается делается вывод о фунгицидном, бактерицидном (ингибирующим) действии изучаемого вещества (приложение 2).

В качестве тест-культуры используют наиболее часто встречающиеся представители нежелательной микрофлоры (гнилостные и маслянокислые бактерии, дрожжи, плесневые грибы).

Лабораторно-практическое занятие 1

Тема : Основные микробиологические методы определения качества кормов. Выделение и учет молочнокислых бактерий.

Цель : Ознакомить студентов с основными микробиологическими методами определения качества кормов; элективными питательными средами №1 и №2; основными биологическими свойствами молочнокислых бактерий.

Время : 4 часа.

Место работы

Оборудование и материалы .

Рабочее место бактериолога, микроскопы, лупы, питательные среды №1 и №2 – по 2 чашки Петри. Тест-культуры молочнокислых микроорганизмов на плотной среде – Lactobacterium plantarum. Таблицы с рисунками молочнокислых бактерий. Термостат. Исследуемый корм (образцы силоса или сенажа). Гомогенизатор. Весы до 1 кг, разновесы. Стерильные чашки Петри – 2 шт. Стерильная водопроводная вода в 0,5 л флаконе. Пипетки 1,0; 5,0; 10,0 мл. Колбы 50,0; 100,0 мл. Бактериологические петли. Спиртовки.

Методические указания

Преподаватель проводит теоретический опрос по теме: «Микробиология силоса и сенажа».

Затем преподаватель дает краткую характеристику микроорганизмам кормов, объясняет микробиологические процессы, происходящие при силосовании и сенажировании.

Далее дает краткую характеристику представителям микрофлоры кормов – эпифитной микрофлоре растений, молочнокислым, маслянокислым и гнилостным бактериям, плесневелым грибам и дрожжам, обращая внимание студентов на морфологию колоний молочнокислых бактерий. Затем преподаватель обращает внимание студентов на масштабы потерь в консервированных кормах, вызванных деятельностью нежелательных микроорганизмов.

Преподаватель дает объяснение понятиям «микозы», «микотоксикозы» (кормовые токсикозы), а также рассказывает о влиянии силоса на обмен веществ животных.

Затем преподаватель знакомит студентов с ингредиентами элективных питательных сред №1 и №2 и назначением этих сред для культивирования молочнокислых групп микроорганизмов. Одновременно с объяснением преподаватель демонстрирует посев суспензии корма на питательные среды.

Методика выявления и учета молочнокислых бактерий .

1. Подготовка исследуемого материала к анализу.

Среднюю пробу (весом 0,5-1,0 кг) исследуемого материала (силоса или сенажа) тщательно перемешивают (с соблюдением основных правил асептики) и измельчают на кусочки длиной 1-2 см. Затем навеску (50 г) хорошо перемешанной средней пробы помещают в стерильный гомогенизатор марки типа М.S.E. Ato-mix, добавляют 450 мл стерильной водопроводной воды и в течение 1 минуты гомогенизируют. Полученную суспензию разбавляют до 10 5 -10 6 раз стерильной водопроводной водой (5 мл суспензии + 45 мл воды), взбалтывают каждое разведение в течение 5 минут.

2. Высев суспензии на элективные среды (приложение) проводится по 1 мл суспензии – при глубинном посеве, по 0,05-0,1 мл суспензии при посеве в жидкие среды.

3. Определение количества молочнокислых бактерий проводят на капустном агаре с мелом (среда 1) и на капустном агаре со спиртом и мелом (среда 2) – глубинный посев.

Подсчет колоний молочнокислых бактерий на капустном агаре с мелом проводится на 5-6 день, а на капустном агаре со спиртом и мелом – на 7-10 день (при 28 0).

Среда 2 необходима для выявления молочнокислых бактерий в составе эпифитной микрофлоры и свежих (с высоким содержанием сухого вещества) силосов, так как спирт заметно тормозит рост посторонней микрофлоры.

Посевы ставят в термостат при 28С на 5-10 суток.

Самостоятельная работа студентов .

1. Студенты записывают в тетрадь из таблицы морфологию молочнокислых бактерий, в т.ч. характер роста колоний, рецепты питательных сред.

2. На последующем занятии проводят подсчет колоний на среде №1 на 5-6 день, а на среде №2 – на 7-10 день.

Контрольные вопросы .

1. Какая микрофлора называется эпифитной?

2. Какие микроорганизмы относят к молочнокислым? Какова их роль при силосовании?

3. Методы выделения и учета молочнокислых бактерий.

Подведение итогов занятия :

Выставление оценок по теоретической части; прием выполненной практической работы; изложение замечаний.

Домашнее задание .

1. Микробиология кормов (силоса и сенажа).

2. Маслянокислое брожение.

Литература.

1. C.124-135; С.267-293

5. С.448-452

6. С.429-453

Лабораторно-практическое занятие 2.

Тема : Основные микробиологические методы определения качества кормов. Выделение и учет маслянокислых бактерий.

Цель : Ознакомить студентов с основными методами определения качества кормов; рецептом приготовления элективной питательной среды №5; основными биологическими свойствами маслянокислых бактерий.

Время : 4 часа.

Место работы : лаборатория кафедры микробиологии и вирусологии.

Оборудование и материалы .

Рабочее место бактериолога, микроскопы, лупы, питательная среда №5 в количестве 4 пробирок. Тест-культуры маслянокислых бактерий в жидкой среде – Clostridium butyricum; предварительно выполненные посевы тест-культуры на среде №5 (по 4 пробирки). Таблицы с рисунками маслянокислых бактерий. Термостат. Исследуемый корм (образцы силоса или сенажа). Гомогенизатор. Весы до 1 кг, разновесы. Стерильные Петри – 4 шт. Стерильная водопроводная вода в 0,5 л флаконе. Пипетки 1,0; 5,0; 10,0 мл. Колбы 50,0; 100,0 мл. Бактериологические петли. Спиртовки.

Методические указания (объяснение основных вопросов темы).

Преподаватель проводит теоретический опрос

Главная > Учебно-методическое пособие

Занятие № 11

Тема : Микробиологическое исследование кормов. Цель занятия: Обучить методам исследования грубых и сочных кормов. Материалы и оборудование : предметные стекла, покровные стекла, препаровальные иглы, посев силоса (10 -6 , 10 -7 разведения) в МПБ, суспензия силоса, индикаторные бумажки для определения рН, посев силоса (10 -6 разведение) на МПА, увлажненные солома и зерно, посев зерна и соломы методом аппликации на МПА. Демонстрация : 1. Рост Cl.perfingens на среде ВильсонБлера; 2. Рост грибков на плотных средах; 3. Рост гнилостных бактерий в МПБ; 4. ИФА для выявления токсина ботулизма. Вопросы для обсуждения : 1. Что такое эпифитная микрофлора и какое ее значение? 2. Почему высушенное сено можно долго хранить? 3. Механизм губительного действия высушивания на микробы. 4. Что лежит в основе силосования корма? Методы силосования сочных кормов. 5. Микроорганизмы, способствующие хорошему качеству силосования. 6. Фазы созревания силосной массы. 7. Методы определения качества силоса.

I . Введение

Грубые корма разнообразны в ботаническом отношении и неоднородны в физическом состоянии. Каждый из них имеет свою технологию и способ хранения, при нарушении которых нередко происходит их порча. Так, например, при увлажнении корма создаются благоприятные условия для размножения гнилостной микрофлоры, плесневых грибов, актиномицетов, которые, развиваясь на растении, используют углеводы, белки, витамины и т.д. и тем самым снижают питательную ценность корма. Кроме того, ряд микроорганизмов могут в процессе своей жизнедеятельности выделять целый ряд токсических продуктов, вызывающих отравление животных. Всесторонний качественный и количественный анализ кормов довольно затруднен, так как не существует универсальной среды, на которой можно вырастить все встречающиеся виды микроорганизмов. Чаще всего при анализе грубых кормов определяют: 1) санитарную пригодность корма и его общую обсемененность; 2) наличие споровой микрофлоры, способной вызвать заболевания животных (сибирской язвой, эмфизематозным карбункулом, ботулизмом и др.); 3) микрофлору, вызывающую порчу кормов в процессе их хранения; 4) эпифитную микрофлору, играющую большую роль в процессе силосования (гнилостную, молочнокислую, маслянокислую и др.).

II . Микологическое исследование грубых кормов

Среди микрофлоры, вызывающей порчу грубых кормов, видное место занимают грибы. Известно, что корма, пораженные грибками, могут вызывать микозы и микотоксикозы. Первые возникают при попадании в организм и развитии самого грибка, вторые  на почве отравления токсинами (ядовитыми продуктами) грибков, развивающихся на кормах. Поэтому исследование пораженных грибами кормов ведут в двух направлениях: 1) обнаружение и выделение грибковвозбудителей болезней; 2) определение их токсичности. Наиболее токсичные свойства обнаружены у многих видов Aspergillus и Fusarium, встречающихся на соломе и мякине злаков, в почве и различных продуктах. При микологическом исследовании грубых кормов используют препарат “раздавленная капля” или выделяют чистую культуру грибков. Для этого в чашки Петри помещают два кружка фильтровальной бумаги (между которыми кладут тонкий слой ваты), завертывают их и стерилизуют в сушильном шкафу. Перед посевом кружки фильтровальной бумаги увлажняют питательной средой (Чапека или ВанИнтерсена) и раскладывают на них исследуемый корм. Ровные отрезки соломки (1.52 см) располагают по радиусу на расстоянии 12 см друг от друга. Культивирование производят в термостате при температуре 2426 о С в течение 1012 дней. При появлении вокруг соломинок черных, сажистых колоний производят микроскопирование и отсев на косой агар (суслоагар, плотную среду Чапека) для получения чистой культуры. При определении видового состава обращают внимание на строение органов спороношения.

III . Определение токсичности грибков

Для испытания токсичности выделенных культур грибков их размножают на доброкачественной соломе, увлажненной жидкой средой (Чапека или ВанИнтерсена) и простерилизованной в автоклаве при 120 о С в течение 3040 минут. Культивирование грибка производят при 2025 о С в течение 23 недель. Затем культуру убивают текучим паром (в течение часа), соломинки высушивают при 4045 о С и извлекают токсин. Экстрагирование токсина производят этиловым эфиром (в течение 6 часов). Вытяжку сгущают и наносят на свежевыбритый участок кожи кролику (ставят дермонекротическую пробу). В качестве контроля на другой участок выбритой кожи наносят вытяжку, полученную из доброкачественной саломы. Если выделенный гриб образует токсин, то вытяжка из него на 34-е сутки вызовет воспалительную реакцию: отечность, покраснение и омертвление ткани. На месте нанесения контрольной вытяжки изменений на коже не произойдет. Токсин (Аг?) можно определить реакцией преципитации с сыворотками. Элементарным условием сохранения кормов от заплеснения является обеспечение их сухого состояния. Эта задача решается своевременной уборкой кормов, правильным скирдованием и повседневной борьбой с повышением влажности во время хранения.

IV . Исследование кормов на ботулизм

У лошадей и других животных иногда возникают массовые заболевания, связанные с отравлением их токсином ботулизма. Материалом для исследования в этих случаях могут быть остатки несъеденного корма или содержимое желудка падших животных. Внешне этот корм ничем не отличается от доброкачественного, и выделить культуру возбудителя из него не всегда удается. Поэтому прибегают к постановке биологической пробы на морских свинках или выявляют токсин серологическими реакциями. 1. Присланные пробы корма растирают в ступке с постепенным добавлением физраствора (1:2) и оставляют при комнатной температуре на 12 часа. 2. Полученную взвесь фильтруют через бумажный фильтр и центрифугируют. 3. 12 мл полученной жидкости с помощью шприца спаивают двум морским свинкам. При наличии токсина ботулинуса морские свинки погибают в течение 35 суток при явлениях параличей мышц брюшной стенки и задних конечностей. 4. С фильтратом ставят реакции преципитации и ИФА. 5. Из осадка делают посев в две колбы с бульоном КиттТароцци под маслом (предварительно прокипяченным) и быстро охлаждают.

После посева одну из колб прогревают при 80 о С в течение 20 минут (для уничтожения неспоровых бактерий) и культивируют в термостате при 37 о С в течение 47 дней. При появлении в колбе роста из содержимого делают мазки, окрашивают их по Граму и просматривают с иммерсией. Палочка ботулинуса плектридиальной формы, грамположительная, чистую культуру ее получают в анаэробных условиях на кровяном агаре. Токсичность культуры проверяют на белых мышах, морских свинках или реакциями преципитации и ИФА.

V. Микробиологическое исследование силоса

Силос является одной из главных составных частей кормового рациона сельскохозяйственных животных, поэтому его качественному приготовлению уделяется большое внимание. В основе созревания силоса лежат микробиологические процессы. Одни из этих процессов (как, например, молочнокислое брожение) являются причиной созревания и консервирования силоса, тогда как другие (маслянокислое брожение, гниение) вызывают порчу корма. Оценка качества силоса производится по органолептическим, химическим и микробиологическим показателям. Для контроля за ходом силосования пробы рекомендуется брать в три срока:

в момент закладки силосуемой массы (на количественный и качественный состав эпифитной микрофлоры); после созревания силоса (на 1030-й день после закладки);

3) в момент вскрытия силосного сооружения. В связи с тем, что в разных слоях силосной массы создаются неодинаковые условия для развития микрофлоры, из крупных силосных сооружений (башни, ямы или траншеи) берут не менее трех проб по вертикали: из верхней, центральной и нижней частей.Из подозрительных участков стога или из кормушек забирают остатки корма (100200 г), упаковывают их в два-три слоя чистой бумаги, этикетируют и направляют в лабораторию. Исследование грубых кормов начинают с определения его ботанического состава, затем описывают органолептические свойства (цвет корма, наличие налетов, расположение налетов и их окраску и т.д.) и только потом проводят полный бактериологический анализ. Растительные корма богаты разнообразной бактериальной и грибковой микрофлорой (количество бактерий в 1 г различных растений доходит до 100000 клеток). Однако высокая обсемененность корма сама по себе без учета качественного состава микрофлоры не решает вопроса о его непригодности для вскармливания. Так, например, большая обсемененность травы и свежего сена псевдомонадами или молочнокислыми кокками и палочками является хорошим показателем, Тогда как высокая обсемененность корма бактериями группы E.coli или анаэробными бациллами Cl.perfingens ввиду их потенциальной патогенности является неблагоприятным санитарным показателем.

Органолептическая оценка силоса

При органолептическом исследовании обращают внимание на физические свойства силоса: структуру, цвет, запах и вкус силосующейся массы. Хороший силос отличается сохранением структур стеблей и листьев. Цвет их под влиянием органических кислот несколько изменяется до желто-оливкового. На воздухе силос быстро темнеет, поэтому определение цвета его следует производить сразу после взятия пробы из силосной массы. Если корм приобрел очень темный цвет, почти черный и стал бесструктурным, это указывает на процессы гниения; такой корм – недоброкачественный.Запах доброкачественного силоса приятный, напоминающий запах свежего ржаного хлеба, квашеной капусты, соленых огурцов или моченых яблок, иногда слегка спиртовой. Последний обуславливается развитием молочно-кислых бактерий и дрожжей. Резко кислый запах указывает на большое содержание уксусной кислоты, что свидетельствует о более низком качестве силоса. Затхлый и гнилостный запах указывает на обильное развитие в силосе плесеней и гнилостных бактерий, вызывающих порчу корма. Неприятный запах придает силосу масляная кислота, образующаяся в результате неправильно проведенного силосования и указывающая на недоброкачественность силоса.

Определение кислотности силоса

Наиболее ярким показателем микробиологических процессов, протекающих в силосе, является его рН. Определение производится ионометром или колометрическим методом по Михаэльсу.Для этой цели из силоса готовят вытяжку или путем настаивания в течение суток одной части силоса с 45 частями дистиллированной воды (для прекращения брожения обычно добавляют толуол), или эту навеску силоса (20 г) предварительно растирают в фарфоровой ступке, переносят в колбочку, а затем заливают дистиллированной водой (80 мл). Силос с водой энергично взбалтывают (в первом случае 45 раз, во втором – в течение 5 минут), фильтруют через бумажный фильтр и прозрачный фильтрат сразу используют для определения рН.В доброкачественном силосе рН должно быть не выше 4.04.2.

Микробиологическое исследование силоса

Для общего ознакомления с микрофлорой силоса производят его микроскопическое исследование. Для этой цели небольшое количество силоса (12 г) тщательно растирают в стерильной ступке с 12 мл стерильной воды и из полученной массы делают обычным способом мазок. Мазок сушат, фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают водным раствором какого-нибудь анилинового красителя. Лучше всего окрашивать мазки из силоса карболовым эритрозином (5%-ный раствор карболовой кислоты  100 мл, сухого эритрозина  2 г); окраска производится в течение 2030 минут. Обычно в мазках, приготовленных из доброкачественного силоса, обнаруживается большое количество палочек, стрептококки, дрожжи. Наличие в препарате плесневых грибков указывает на порчу силоса. Для характеристики качества силоса производят определение общего числа микроорганизмов и их групповой учет. При этом прежде всего готовят разведение силоса (5 г) и переносят его в колбу со 100 мл стерильной воды. Силос с водой энергично взбалтывают в течение 10 минут и из полученного исходного разведения 1:10 готовят последующие разведения. Для приготовления разведения берут 67 пробирок, в которые предварительно наливают по 9 мл стерильной воды. Затем в первую из них пипеткой вносят 1 мл разведения силоса 1:10 (из колбы), тщательно взбалтывают в течение 35 минут и 1 мл полученного разведения 1:100 переносят в следующую пробирку и т.д. Таким образом готовят последующие разведения до 10 -6  10 -7 .

Определение в силосе общего количества бактерий

Для этого посев суспензии производят на МПА, в двухкратной повторности. Если силос находится в стадии брожения, для посева берут разведения 10 -6  10 -7 , при исследовании старого силоса 10 -6  10 -5 и даже меньше. Посев производят следующим образом: стерильной градуированной пипеткой асептично берут 1 мл соответствующего разведения (для каждого разведения нужна отдельная пипетка) и вносят в пустую чашку Петри. Затем в чашку наливают предварительно расплавленный и охлажденный до 50 о С мясо-пептонный агар.

Учет молочнокислых бактерий

Производят путем посева 34 разведений силосной массы на сусло-агаре с мелом (сусло-агар готовят из пива, разведенного водой 1:1 с добавлением 1.52%-ного агар-агара). Посевы выдерживают 34 дня в термостате при температуре 3035 о С. Вследствие образования кислоты и растворения мела колонии молочнокислых микробов образуют на твердых средах с мелом зоны просветления.

Определение количества маслянокислых бактерий

Производят путем посева 34 разведений силоса на картофельную среду Рушмана или на среду Е. Н. Мишустина следующего состава: крахмал  0.5 г; пептон  5.0 г; K 2 HPO 4  1.0 г; мел  5.0 г; водопроводная вода  1000 мл. Среда разливается по пробиркам с поплавками и стерилизуется в автоклаве при 1 атмосфере 20 минут. Различные разведения силосной массы (от 1:100 до 1:10 000) засевают в пробирки с питательной средой в количестве 1 мл (каждое разведение засевают параллельно в 23 пробирки). Часть из них после посева прогревают при температуре 80 о С в течение 1015 минут, а затем засеянные пробирки выдерживают в термостате при температуре 3540 о С до 10 суток. В процессе роста маслянокислых бактерий отмечают газообразование, гидролиз, растворение мела и запах прогорклого масла.

Определение гнилостных бактерий

Выполняют с помощью посевов 34 разведений силоса на МПБ, при этом между пробиркой и пробкой вставляют полоску фильтровальной бумаги, смоченную 10%-ным раствором уксуснокислого свинца, и красную лакмусовую бумажку. Гнилостные бактерии вызывают помутнение среды и образование H 2 S, которую определяют по почернению индикаторной бумажки, смоченной уксуснокислым свинцом, или посинению лакмусовой бумажки при выделении аммиака.

Определение количества дрожжей и плесени

Производят путем посева силоса на сусло-агар без добавления мела. Посев производят, как описано выше, из разведений силоса 1:1000  1:10000. Засеянные чашки Петри выращивают при температуре 2025 о С и подсчет выросших колоний производят через 4 суток. Для пересчета всех данных рекомендуется пользоваться таблицами МакКреди. Оценка результатов микробиологического исследования силоса Твердых микробиологических норм, характеризующих качество силоса, не имеется, и результаты микробиологического исследования дают лишь общее представление о ходе процессов в силосе. Показателями нормально протекающего процесса созревания силоса являются: низкое рН (4), преобладание молочнокислых бактерий (110 млн.), небольшое количество плесеней (до 4 тыс.), бактерий группы кишечной палочки (2500 млн.) и маслянокислых бацилл (250 млн.). Зрелый силос, в котором правильно протекали микробные процессы, беден микроорганизмами, в то же время силос богат органическими и минеральными веществами, которые находятся в легкоусвояемой форме. Все это делает силос ценным пищевым продуктом для сельскохозяйственных животных. Ход работы : I. Определить титр Cl.perfingens на среде ВильсонБлера:

Взвесить 0.1 г измельченного корма, поместить в колбу с 10 мл стерильного физиологического раствора и тщательно взболтать в течение 5 минут; Затем 1мл полученной суспензии внести в стерильную чашку Петри и залить питательной средой ВильсонБлера (100 мл 3%-ного МПА и 1%-ной глюкозы); растапливают в водяной бане и добавляют 10 мл 20%-ного раствора сульфита натрия и 1 мл 8%-ного хлористого натрия. Оба раствора готовят на стерильной дистиллированной воде и кипятят; Через сутки инкубирования в анаэростате при 37 градусах чашки Петри просматривают и отмечают результаты:

 отсутствие колоний  чистый корм;  13 колонии  слабозагрязненный корм;  310 колоний  умеренно загрязненный корм;  более 10 колоний  сильнозагрязненный корм; II. Приготовить препарат "раздавленная капля" из мицелия грибков на агаре и из увлажненного грубого корма (зерна, соломы):

Пораженное растение тщательно осмотреть и установить наличие или отсутствие спороношения; Выявленные на поверхности пораженной ткани спороношения в виде налета подушечек или плодовых тел снять препаровальной иглой и перенести на предметное стекло в каплю 50%-ного раствора глицерина или молочной кислоты;

Налет расправить иглами, накрыть покровным стеклом и изучить с сухими системами микроскопа (8´15 и 40´7); Промикроскопировать, изучить морфологию грибков, зарисовать.

III. Приготовить препарат из колоний, выросших вокруг зерен, соломы, разложенных на МПА. Окрасить по Граму, промикроскопировать, зарисовать. IV.Ознакомиться с общей микрофлорой силоса. Из суспензии силоса приготовить препарат, окрасить метиленовой синькой. Промикроскопировать,зарисовать. VI. Определить с помощью индикаторной бумажки рН силоса; VII.Определить общее число бактерий в 1 г силоса. Для этого подсчитать число колоний на МПА и умножить на степень разведения. VIII. Определить по росту на МПБ наличие в силосе гнилостных бактерий. IX. Учесть реакцию ИФА для выявления токсина ботулизма. X. Результаты исследований занести в протокол. Тесты для проверки знаний: 1. К органолептическим свойствам силоса относят: а) структуру, б) влажность, в) рН, г) цвет, д) запах. Ответ: а, г, д 2. При микробиологическом исследовании силоса определяют: а) ОМЧ, б) БГКП, в) споровые бактерии, г) маслянокислые, д) молочнокислые, е) Гр(+) Ответ: а, б, г, д Ключевые слова : эпифитная микрофлора, микрофлора корма, силос, маслянокислое брожение, гниение, молочнокислое брожение.

Занятие № 12

Тема : Микробиологическое исследование молока и молочнокислых продуктов. Цель занятия: Обучить методам исследования молока и молочнокислых продуктов. Материалы и оборудование : Стерильная посуда (пипетки, микропипетки, чашки Петри, пробирки, скальпель), набор красителей, предметные стекла, 1%-ный водный раствор метиленовой синьки, жидкость Никифорова, МПА (высокие столбики), стерильная водопроводная вода по 9 мл в пробирках и по 20 мл, молоко, кисломолочные продукты (сметана, кефир или кефирные зерна). Демонстрация : 1. Опыт в пробирках для определения редуктазы в молоке. 2. Опыт в чашках Петри для определения лизоцима в молоке. 3. Чашки с ростом для определения микробного числа молока. 4. Стерильные среды Эндо, Козера, Кесслера с глюкозой. 5. Среды с ростом БГКП Кесслера, Эндо, Козера и среда с глюкозой. Вопросы для обсуждения : 1. Источники микрофлоры молока. 2. Смена фаз при хранении молока. 3. Молоко как возможный источник патогенных микробов. 4. Порок молока, микробы – участники. 5. Какие вам известны способы консервирования молока? 6. Методы микробиологического исследования молока. 7. Как взять пробу молока для бактериологического исследования? 8. Какими требованиями должно отвечать молоко группы А? 9. Какие вы знаете кисломолочные продукты? 10. Какие микроорганизмы участвуют в молочнокислом брожении? 12. Микробиология маслоделия, сыроделия. 13. Какие вы знаете пороки микробного происхождения, связанные с хра- нением масла и сыра?

I . Введение

Молоко является продуктом питания и средой для развития микроорганизмов. Качество молока определяется рядом показателей  физических, химических и бактериологических. Физические и химические показатели характеризуют питательную ценность молока, а бактериологические позволяют судить о свежести молока и степени его загрязнения. При помощи этих показателей можно контролировать санитарные требования при дойке, обработке, хранении и транспортировке молока. Некоторые бактериологические показатели (наряду с физическими и химическими) характеризуют состояние вымени животного, т. е. наличие или отсутствие в нем воспалительного процесса. Микрофлора молока складывается из ряда источников: 1) микрофлора вымени; 2) внешние источники заражения молока (кожа животного, посуда и аппаратура, вода, корм, подстилка, воздух, тело и одежда доярки) как источники первичной микрофлоры молока. Вторичная микрофлора молока  это накопление микрофлоры в молоке путем размножения ранее попавших в него микроорганизмов.

II . Взятие материала для исследования молока

В зависимости от поставленных задач исследования пробы молока берут от одной определенной коровы или от группы коров. При взятии пробы молока от одной коровы: 1) готовят стерильную посуду; 2) вымя коровы тщательно моют теплой водой с мылом, протирают стерильным полотенцем, соски дезинфицируют ватным тампоном, смоченным спиртом; 3) доильщицы тщательно моют и дезинфицируют руки; 4) из каждого соска поочередно молоко сдаивают в стерильную посуду: а) первые 34 струйки (при исследовании это микрофлора кожи животного), в пищу они не идут и не уничтожаются; б) средние струйки (микрофлора молока); в) последние струйки (микрофлора вымени). При исследовании последних струек молока и наличии в них лейкоцитов и микроорганизмов можно выявить мастит (воспаление молочной железы). Все пробы этикетируются и направляются на исследование в лабораторию.При взятии молока от группы коров: 1) молоко во флягах тщательно перемешивают мутовкой медленными круговыми движениями; 2) забор проб молока производят стерильным пробником (длинная стеклянная трубка) в количестве 50 мл и сливают в стерильный флакон. Флакон закрывают над пламенем спиртовки ватной пробкой. Нумеруют, на этикеткеуказывают дату взятия пробы (число и час), а также фамилию, имя, отчество и должность лица, производившего взятие пробы. Исследование взятых проб молока производят сразу или не позднее 2-х часов с момента взятия проб. Если молоко не может быть немедленно исследовано, то его охлаждают до + 46 о С, хранят и транспортируют при этой же температуре.Основными бактериологическими показателями, характеризующими свежесть молока и его чистоту, являются: а) количество бактерий в 1 мл молока (микробное число), б) коли-титр молока (наименьший объем молока, в котором обнаружена одна БГКП). Микробное число молока можно определить: 1) бактериологическим способом (высев определенного объема молока на специальные среды с последующим подсчетом выросших колоний; 2) методом прямого подсчета бактерий под микроскопом (метод Брида, Королева, Разумовой и т.д.); 3) косвенными методами : а) с помощью пробы на редуктазу; б) с помощью пробы с резазурином.

1. Микробиологическое исследование

молочнокислых продуктов

Типичные молочнокислые бактерии неподвижны, Гр (+), слабо или совсем не растут на МП-ых средах. Молочнокислые бактерии молока при сбраживании углеводов образуют в основном молочную кислоту, побочные продукты обычно мало заметны. Но встречаются молочнокислые бактерии, которые при брожении наряду с молочной кислотой образуют значительное количество летучих кислот (уксусной, углекислоты), спирт, диацетил и при развитии совместно с активными молочнокислыми бактериями придают молочным продуктам своеобразный специфический вкус и аромат. Молочнокислые микроорганизмы представлены тремя группами: молочнокислые стрептококки, молочнокислые палочки, дрожжи. Ход работы: I. Определить количество бактерий в 1 мл молока (методом посева):

Приготовить серийное разведение молока: а) взять 4 пробирки с 9 мл водопроводной воды и подписать: № 1, 2, 3, 4; б) взятую пробу молока тщательно взболтать и стерильной пипеткой набрать из нее 1 мл молока и внести в пробирку № 1, тщательно перемешать, соблюдая все правила асептики, и перенести в пробирку № 2 и т.д. Вы получите разведения молока: № 1 (1:10), № 2 (1:100), № 3 (1:1000), № 4 (1:10000).

Взять 1 стерильную чашку Петри, подписать "молоко 1:10000". В чашку внести 1 мл из пробирки № 4, залить чашку расплавленным и охлажденным до 4550 о С МПА (15 мл). Образовавшуюся смесь тщательно перемешать путем вращения чашки и оставить на столе до полного застывания агара.

Чашку перевернуть вверх дном и поставить в термостат на 48 часов.

По демонстрационным чашкам подсчитать микробное число.

II. Провести микроскопическое исследование кисломолочных продуктов:

Приготовить мазок из сметаны, высушить на воздухе, зафиксировать в жидкости Никифорова и окрасить метиленовой синькой (3 мин). Мазок промыть, подсушить фильтровальной бумагой. Промикроскопировать с иммерсионной системой. Отметить наличие молочнокислых стрептококков, палочек и дрожжей, сбраживающих лактозу. Приготовить мазок из кефира: а) зерно кефира поместить между двумя стерильными стеклами и раздавить его; б) полученные на стекле отпечатки высушить, зафиксировать и окрасить метиленовой синькой, промикроскопировать, зарисовать и отметить наличие единичных дрожжей, молочнокислых стрептококков, молочнокислых бактерий и палочки стромы.

Тесты для проверки знаний: 1. Молоко 1 класса имеет следующие характеристики: а) сине-стальную окраску, б) количество бактерий > 20 млн/мл, в) количество бактерий < 20 млн/мл, г) белую окраску, д) количество бактерий менее 500 тыс/мл. Ответ: а, д 2. В лаборатории имеется: 1) сырое цельное молоко, 2) пастеризованный обрат, 3) сыворотка молочная, а также закваски: а) молочный срептококк, б) ацидофильная палочка. Что необходимо использовать, чтобы приготовить ацидофилин для телят? Ответ: 1, 3 б Ключевые слова : ОМЧ молока, Coli-титр молока, молочнокислые бактерии, кисломолочные продукты

Занятие № 13

Тема : Препараты, используемые для лечения, профилактики и диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. Цель занятия: Изучить вакцины, сыворотки, иммуноглобулины, аллергены и способы их применения. Материалы и оборудование: Набор препаратов лечебного, профилактического и диагностического назначения в животноводстве. Вопросы для обсуждения : 1. Вакцины, их назначение, виды вакцин. 2. Иммунные сыворотки, их назначение. 3. Способы получения лечебно-профилактических препаратов. 4. Иммуноглобулины, их назначение. 5. Аллергены, их получение и использование. 6. Диагностические сыворотки, их получение, применение. 7. Диагностикумы, их получение, применение. 8. Применение бактериофагов для лечения и диагностики.

I . Профилактические и лечебные препараты

Одним из важнейших направлений прикладной иммунологии является создание эффективных препаратов для иммунопрофилактики и иммунотерапии инфекционных заболеваний. Среди таких препаратов различают: 1. Вакцины и анатоксины. 2. Иммунные сыворотки и иммуноглобулины.

Вакцины

Вакцины  препараты, используемые для активной иммунизации людей и животных. Э.Дженнером была получена первая вакцина, содержащая вирус коровьей оспы (vacca - корова). Название вакцины было дано Л. Пастером всем прививочным препаратам, полученным из микроорганизмов и их продуктов. Вакцины должны обладать определенными свойствами (физико-химическими, антигенными) и при правильном дозировании и введении животным давать соответствующую реакцию и создавать активный иммунитет против той или иной болезни.Различают вакцины живые, убитые, субъединичные, генно-инженерные и другие. Живые вакцины изготовляют из специально полученных штаммов микроорганизмов с ослабленной вирулентностью и полноценными иммуногенными свойствами. Для этого вначале прибегают к селекции и направленному изменению бактериальных культур и вирусов (на фоне сохраненной антигенной структуры). Это достигается: выращиванием возбудителя в средах, недостаточно для его развития благоприятных (туберкулезная вакцина в БЦЖ); пассажами через организм маловосприимчивых животных (вакцина против рожи свиней, вакцина против бешенства, вакцина против вируса чумы свиней и вируса Ньюкастловской болезни); обработкой химическими веществами и физическими агентами (вакцины против пастереллеза птиц, против сибирской язвы (СТИ, ГНТИ), вакцины Ценковского, бруцеллеза ВА-19, против паратифа телят Т с -177). Живые вакцины обычно более эффективны, создают, как правило, напряженный иммунитет, сходный с постинфекционным. В большинстве случаев достаточно бывает однократной вакцинации живой вакцины, так как вакцинный штамм может размножаться и персистировать в организме.Однако после их применения могут возникнуть поствакцинальные осложнения, особенно у животных с пониженной резистентностью к заболеваниям. Вакцины чаще леофильно высушивают: из замороженного состояния, в вакууме. Убитые вакцины представляют собой взвесь убитых (инактивированных) микроорганизмов. Их готовят из штаммов микроорганизмов, обладающих максимально выраженными иммуногенными свойствами. Для инактивации вакцин используют разные методы: нагревание, УФ-лучи, ультразвук, химические вещества (спирт, формалин, фенол и другие). Инактивацию проводят в условиях, исключающих денатаруцию антигенов. Примерами убитых вакцин могут служить: формолвакцина против эмфизематозного карбункула, формолвакцина против оспы свиней и против паратифа телят. Вакцины, содержащие убитые микробы, безопасны, вызывают медленное образование иммунитета и менее эффективны в условиях действующего очага инфекции. Следует учитывать, что аттенуированный (ослабленный) или убитый возбудитель  это множество различных антигенных детерминант, из которых протективностью, т.е. способностью индуцировать защитный иммунитет, обладают очень немногие. В связи с этим целесообразно усовершенствовать вакцины путем использования компонентов бактериальной клетки и вирионов, обладающих наиболее выраженным протективным действием. Вакцины, содержащие отдельные антигенные комплексы микробных клеток и вирионов, называют субъединичными . При введении их в организм субъединичные вакцины благодаря хорошей растворимости и относительно низкой молекулярной массе быстро метаболируются и выводятся из организма, не обеспечивая длительного иммуногенного раздражения. Поэтому к ним обычно добавляют вещества-адъюванты (adjuvans - помогающий): гидроокись аммония, алюмо-калиевые квасцы, фосфаты аммония, кальция и другие. Адъюванты укрупняют антигенные частицы, созюдают в месте введения депо (депонированные вакцины), т.е. удлиняют период иммуногенного раздражения. Кроме того, адъюванты усиливают фагоцитоз, митоз иммунокомпетентных клеток. Генно-инженерные вакцины получают поэтапно. Сначала составляют генетическую карту генома данного возбудителя. Затем гены, контролирующие протективные антигены, переносят в геном других микроорганизмов, например в дрожжевую клетку или кишечную палочку, клонируют в них, добиваясь экспрессии этих генов в новых условиях. Синтезируемые новыми клетками антигены (белки) очищают от балластных веществ и адсорбируют на адъювантах. Созданы генно-инженерные вакцины против ящура, бешенства. Ассоциированные вакцины . Большое значение в животноводстве имеет ассоциированная иммунизация, т.е. введение в организм ассоциированных вакцин, содержащих одновременно антигены нескольких возбудителей, например: ассоциированная вакцина против эмфизематозного карбункула, злокачественного отека и пастереллеза крупного рогатого скота, ассоциированная вакцина против ботулизма и пастереллеза норок.

Анатоксины

Анатоксины используют для создания искусственного активного антитоксического иммунитета (столбняк, ботулизм и другие). Анатоксин представляет собой экзотоксин (фильтрат бульонной культуры токсигенного микроба), обезвреженный длительным (1830 дней) воздействием формалина при температуре 3740 о С. Анатоксин контролируют на стерильность, безвредность и иммуногенность. Анатоксины очищают от балластных белков и адсорбируют на адъювантах.

Иммунные сыворотки и иммуноглобулины

При многих бактериальных и вирусных инфекциях антитела играют защитную роль, нейтрализуя токсины и внеклеточные вирусы, способствуют очищению организма от возбудителя. Однако накопление достаточного количества антител наблюдается, как правило, не ранее чем через 23 недели после начала заболевания. Поэтому для создания искусственного пассивного иммунитета используют введение животным иммунных сывороток или иммуноглобулинов.Сыворотки применяют с профилактическими и лечебными целями. Для профилактики их используют, когда имеется непосредственная опасность заражения, например, столбняком, анаэробными инфекциями при ранении. Сыворотку вводят чаще внутримышечно или внутривенно. Иммунные сыворотки получают путем многократной иммунизации лошадей, от которых можно получить сравнительно много крови. Животных иммунизируют соответствующими антигенами: анатоксинами для получения антитоксических сывороток и вакцинами для получения антибактериальных и антивирусных сывороток. После окончания иммунизации у животного стерильно берут кровь, из которой получают сыворотку. Сыворотку проверяют на активность (титр антител), стерильность, безвредность, очищают от балластных белков. Чаще для этого применяют метод ферментативного гидролиза, осаждение активных фракций сульфатом аммония и диализ  «Диаферм» . Из сывороток получают иммуноглобулины путем спиртоводного осаждения при низкой температуре. Из крови гипериммунизированных животных получают иммуноглобулины против бешенства, сибирской язвы, чумы, лептоспироза и т.д.

II . Диагностические препараты

Диагностические препараты используются для: 1) определения с помощью специальных иммунных сывороток вида и типа микроорганизма, выделенного от больного животного; 2) обнаружения антител в сыворотке больного животного;

выявления аллергической перестройки организма, возникающей при некоторых инфекционных заболеваниях.

Диагностические сыворотки

Диагностические сыворотки содержат специфические антитела, с их помощью можно выделить антигены соответствующего возбудителя. Диагностические сыворотки подразделяются на агглютинирующие, преципитирующие, нейтрализующие, люминисцентные, меченые (конъюгированные) ферментом и другие.

Все диагностические иммунные сыворотки готовят путем иммунизации животных (кроликов, лошадей) соответствующим антигеном. Полученные от иммунизированных животных сыворотки титруют (определяют титр соответствующих антител), в стерильных условиях разливают в ампулы. Свободные аминогруппы F c фрагментов антител в иммунных сыворотках можно конъюгировать ферментами, флюоресцентными красителями, изотопами. Эти сыворотки используют для диагностики в реакциях ммунофлюоресцентного и иммуноферментного анализа, радиоиммунного анализа.

Диагностикумы

Диагностикумы используют для определения специфических антител в сыворотке животного. Чаще всего диагностикумы представляют собой гомогенную взвесь убитых микробов или вирусов. Диагностикумы из большинства бактерий готовятся путем инактивации их взвеси формалином, этиловым спиртом, прогреванием и другими методами.В ряде случаев для серодиагностики применяют не целые микроорганизмы, а выделенные из микробных тел антигены. Это достигается различными методами: дезинтеграцией химическими веществами, кипячением, ультразвуком и т.д.

Бактериофаги

Бактериофаги характеризуются высокой специфичностью, поэтому их можно использовать для: 1) фаготерапии  лечения некоторых инфекционных заболеваний; 2) фагопрофилактики  предупреждения некоторых заболеваний; 3) диагностики.

Аллергены

Аллергены  это препараты, которые применяют с целью диагностики соответствующего заболевания, для выявления иммунологической перестройки организма в результате вакцинации или заболевания. Основные требования к аллергенам  высокая чувствительность и специфичность.Микробные аллергены чаще готовят из фильтратов бульонных культур. Вводят накожно, внутрикожно или на конъюктиву глаза. При положительной реакции на месте введения аллергена развивается местная воспалительная реакция: отечность, гиперемия, выделение гноя из внутреннего угла глаза и др. Ход работы: I. Изучить вакцины: а) живые вакцины  БЦЖ, СТИ, б) убитые вакцины, в) субъединичные вакцины. II. Изучить анатоксины: столбнячный, ботулинический. III. Изучить иммунные сыворотки и иммуноглобулины. Просмотреть образцы следующих сывороток: а) сыворотку против сибирской язвы, б) сыворотку против паратифа поросят,в) поливалентную сыворотку против лептоспироза. IV.Изучить аллергены. Просмотреть образцы следующих аллергенов: а) альтуберкулин Коха, б) туберкулин ППД, в) бруцеллизат ВИЭМ, г) бруцеллин ВИЭМ. Разобрать способы введения. V. Изучить диагностические сыворотки: а) агглютинирующую сальмонелезную поливалентную, б) агглютинирующую сальмонелезную групповую О-сыворотку, в) агглютинирующую сальмонелезную типовую Н-сыворотку, г) люминесцирующую сыворотку чумную, д) люминесцирующую сыворотку бруцеллезную, е)преципитирующую сибиреязвенную сыворотку. Просмотреть образцы сывороток, разобрать способы их приготовления, применения. VI. Изучить диагностикумы: а) сальмонелезный ОН-диагностикум, б) бруцеллезный диагностикум, в) эритроцитарный сибиреязвенный диагностикум, г) бруцеллезный эритроцитарный диагностикум. Просмотреть образцы диагностикумов, разобрать способы их получения, применения. VII. Изучить бактериофаги: а) для лечения: стафилококковый, стрептококковый, б) для диагностики: чумной диагностический фаг. Тесты для проверки знаний: 1. Туберкулины для аллергодиагностики животному вводят: а) внутрикожно, б) внутривенно, в) внутримышечно, г) на конъюктиву. Ответ: а, г 2. Для активной иммунизации против сибирской язвы животным вводят: а) противосибиреязвенную сыворотку, б) вакцину СТИ, в) вакцину ГНТИ, г) противосибиреязвенный иммуноглобулин, д) вакцины Ценковского. Ответ: б, в, д 3. Живые вакцины: а) содержат иммуноглобулины, б) создают пассивный иммунитет организма, в) создают активный иммунитет, г) состоят из аттенуированного штамма. Ответ: в, г Ключевые слова : вакцины, иммунные сыворотки, иммуноглобулины, аллергены, диагностикумы, бактериофаги.

ЛИТЕРАТУРА

Вирусные инфекции. Труды института имени Пастера. С.-Пб.: НИИ эпидемиологии и микробиологии, 1992. 122 с. Кочемасова З.Н. и др. Санитарная микробиология и вирусология. М.: Медицина, 1987. 440 с. Красильников А.П. Микробиологический словарь-справочник. Минск: Беларусь, 1986. 210 с. Краткий определитель бактерий. Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1980. 312 с. Лукомская К.А. Микробиология с основами макробиологии. М.: Мир, 1987. 120 с. Покровский В.Н. Бактериофаг – вирус бактерий. М.: Знание, 1986. 310 с. Пяткин К. Д. Микробиология. М.: Медицина, 1971. 352 с.

Стейниер Р., Эдельберг Э., Дж. Ингрэм. Мир микробов. Т.1, 2, 3. М.: Мир, 1979. 270 с.

ПРЕДИСЛОВИЕ ………………………………………………………………. 3 Раздел I. МОРФОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ 1. Правила работы в бактериологической лаборатории. Техника приготовления и простая окраска препаратов. Морфология микроорганизмов ……………………………………………. 4

Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски ………….. 7

Раздел II. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ 3. Питательные среды. Выделение чистых культур бактерий (I этап) …………………………………………………..………. 13 4. Ферменты бактерий. Выделение чистых культур бактерий (II и III этапы). Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, УФО и химическим веществам. Культивирование анаэробов …………………………………. 18 5. Выделение чистых культур (IV этап). Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Понятие о стерилизации и дезинфекции ………………………………………………………………. 23 6. Генетика микроорганизмов ………………………………………………… 28 Раздел III. САНИТАРНОБАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 7. Санитарнобактериологическое изучение природных биоценозов …………………………………………………………………… 31 Раздел IV. ИНФЕКЦИЯ И ИММУНИТЕТ 8. Реакции иммунитета ………………………………………………………... 38 9. Методы лабораторной диагностики инфекционных болезней сельскохозяйственных животных, вызываемых бактериями ……………. 45 10. Лабораторная диагностика вирусных инфекций ………………………….. 50 Раздел V. МИКРОФЛОРА КОРМОВ, МОЛОКА И МОЛОЧНОКИСЛЫХ ПРОДУКТОВ 11. Микробиологическое исследование кормов ………………………………. 53 12. Микробиологическое исследование молока и молочнокислых продуктов …………………………………………………. 62 13. Препараты, используемые для лечения, профилактики и диагностики инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных ………………………………………….. 66 Литература ……………………………………………………………………….. 73

Предисловие (66)

Документ

ПРЕДИСЛОВИЕ Центральный государственный архив научно-технической документации Казахской ССР (ЦГА НТД КазССР) Главного архивного управления при Совете Министров Каз ССР образован постановлением Совета Министров Казахской ССР от 7 февраля

Предисловие (73)

Рассказ

Предисловие Основой рассказов являются подлинные события. Начинаются они разделом "Дороги старокрымских партизан к победе". В нем читатель познакомится не только с геройскими делами партизан, но и убедится, что в годы Великой

ЭПИФИТНАЯ МИКРОФЛОРА ЗЕРНА И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЕ ПРИ ХРАНЕНИИ КОРМА
На поверхности зерна обитает разнообразная микрофлора. Часть микроорганизмов попадает из ризосферы, часть заносится с пылью и насекомыми. Однако на зерне, как и на всей поверхности растений, развиваются лишь некоторые микроорганизмы так называемые эпифиты. Эпифитные микроорганизмы, размножающиеся на поверхности стеблей, листьев и семян растений, получили название микроорганизмов филло-с ф е р ы. Эпифиты питаются продуктами экзосмоса растений. Условия жизни эпифитных бактерий своеобразны. Они довольствуются небольшими запасами питательных веществ на поверхности растений, устойчивы к высоким концентрациям фитонцидов, выдерживают периодические колебания влажности. Поэтому численность их невелика и видовой состав довольно постоянный. Более 90% эпифитных микроорганизмов составляют гнилостные бактерии. В основном эпифит- ная микрофлора представлена неспороносными бактериями. Большую часть бактериального населения зерна составляют неспороносные палочки рода Pseudomonas.активно развивающиеся на поверхности растений. Особенно часто встречается Pseudomonas herbicola (Erwinia herbicola),образующая на плотных средах золотисто-желтые колонии. Встречаются также Pseudomonas fluorescens,микрококки, молочнокислые бактерии, дрожжи. Бациллы и микроскопические грибы составляют небольшой процент.
В определенных условиях эпифитные микроорганизмы могут быть полезны для растений, так как препятствуют проникновению паразитов в ткани растения.
При хранении зерна эпифитные микроорганизмы могут играть отрицательную роль. В зрелом зерне вода находится в связанном состоянии и недоступна микро-организмам. На таком зерне они находятся в состоянии анабиоза (покоя). На развитие микроорганизмов на зерне, а следовательно, на сохранность последнего решающее влияние оказывают: влажность, температура, степень аэрации, целостность зерна и состояние его покровных тканей. На зерне с повышенной влажностью микроорганизмы размножаются тем быстрее, чем выше температура.
Развитие микробиологических процессов в хранящемся зерне с повышенной влажностью приводит к заметному, а иногда и к очень значительному повышению температуры. Это явление получило название термогенеза.
Самосогревание зерна ведет к смене микрофлоры. Свойственная зерну эпифитная микрофлора исчезает. Сначала обильно размножаются непигментированные неспороносные палочки, вытесняющие Erwinia herbicola.Позднее появляются термостойкие (термотолерантные) микрококки, образующие на плотных средах чаще всего мелкие белые плоские колонии, плесневые грибы, актнномицеты. Дальнейшее развитие процесса самосогревания (свыше 40-50°С) способствует развитию спорообразующих и термофильных бактерий.
По мере самосогревания изменяется и видовой состав плесневых грибов. Виды Penicillium,которые преоб-ладали вначале, заменяются видами Aspergillus.
Таким образом, по видовому составу микрофлоры можно судить не только о том, подвергалось ли зерно самосогреванию, но и насколько далеко зашел этот процесс. Преобладание Ertioinia herbicolaв микробном ценозе зерна служит показателем его хороших качеств. Большое количество спорообразующих бактерий и грибов указывает на потерю всхожести семян.
Благоприятные условия для развития на зерне микроорганизмов приводят к накапливанию выделяемых ими токсинов. В результате при сщрмливашш такого зерна скоту и домашней птице часто возникают кормовые отравления.
Таким образом, правильное хранение зерна должно сводиться к тому, чтобы не допускать развития на нем микроорганизмов.
Для количественного учета микроорганизмов на зерне навеску массой 5 г помещают в колбу с 50 мл стерильной водопроводной воды и 2-3 г песка. Колбу взбалтывают круговыми вращательными движениями в течение 10 мин. Из полученной.вытяжки готовят последующие разведения (10~2; 10_3; 10-4). Отдельными стерильными пипетками Мора берут по 10 мл суспензии и переносят в колбы, содержащие по 90 мл стерильной водопроводной воды. Затем из каждой колбы берут по 1 мл суспензии соответствующего разведения в стерильные чашки Петри в двух повторностях. В каждую чашку Петри выливают по 1 пробирке расплавленного, но предварительно охлажденного до 50°С МПА. Чашки инкубируют при температуре 30° С. Наряду с МПА используют элективные среды, описанные в разделе «Анализ силоса».
Через 3-5 дней инкубации подсчитывают общее число колоний, выросших на МПА в чашках, и рассчитывают количество микроорганизмов на 1 г зерна.
Для определения качественного состава микрофлоры зерна колонии группируют по культуральным признакам, из каждой группы колоний готовят препараты, выявляют принадлежность микроорганизмов к роду или семейству и определяют численность бактерий каждой группы в процентах от общего количества микроорганизмов.
Для идентификации выделенные культуры микроорганизмов очищают.
На основании микробиологического анализа, дела-ют заключение о качестве зерна.
На свежем доброкачественном зерне преобладает Erwinia herbicola(до 80%), образующая блестящие оранжевые колонии. Встречаются Pseudomonas fluores- cens,формирующая желтовато-зеленоватые флуоресцирующие колонии, непигментированные неспорообразую-щие палочки, дрожжи (колонии блестящие, выпуклые, часто окрашенные в розовые тона). При учете на сусло- агаре с мелом выявляются молочнокислые бактерии, образующие чечевицеобразные мелкие колонии с зонами растворения мела.
На несвежем зерне, хранившемся в условиях повышенной влажности, Erwinia herbicola, Pseudomas fluo- rescensне выявляются. Обнаруживаются микрококки, образующие мелкие белые блестящие плоские колонии, спорообразующие палочки, актиномицеты, а также неспороносные палочки. При учете на сусло-агаре выявляется значительное количество грибов, главным образом относящихся к роду Penicillium,а также Aspergillus.
Материалы и оборудование. Зерно в колбах свежее и несвежее, хранившееся в условиях повышенной влажности. Весы и разновесы. Часовые стекла. Колбы со стерильной водой (по 90 мл), колбы со стерильной водой (по 50 мл) и песком. Стерильные пипеткн Мора на 10 мл и на 1 мл. Стерильные чашки Петри. МПА в пробирках и колбах. Водяная баня, треножник. Микроскопы и все необходимое для микроскопирсвания.
АНАЛИЗ СИЛОСА
Молочнокислые бактерии, обитающие на растениях, играют большую роль при силосовании кормов. В основе силосования лежит молочнокислое брожение. Молочнокислые бактерии сбраживают сахара силосующихся растений в молочную и частично уксусную кислоту, которые подавляют развитие гнилостных, маслянокислых и других нежелательных бактерий, портящих корм. Молочнокислые бактерии снижают pH корма до 4,2-
Если кислотность силоса по тем или иным причинам уменьшается (pH становится выше 4,5-4,7), то создаются условия, благоприятствующие жизнедеятельности вредных для сохранности кЬрма микроорганизмов.
В нем накапливаются дурно пахнущая масляная кислота, амины, аммиак и другие продукты.
Для того чтобы обеспечить нормальное развитие молочнокислых бактерий в процессе силосования, необ-ходимо достаточное содержание сахара в силосующихся растениях и изоляция корма от доступа воздуха, т. е. создание анаэробных условий.
Плесневые грибы переносят сильное подкисление, но являются строгими аэробами, поэтому в хорошо спрессованном, укрытом, заквашенном корме размножаться не могут.
Если проследить за распадом сахара и образованием органических кислот в процессе силосования, то можно заметить, что с уменьшением сахара увеличивается количество органических кислот. Однако снижение pH зависит не только от количества молочной и уксусной кислот, но и от буферности растительного материала, которая, в свою очередь, зависит от белка, солей. Чем больше буферность растительной массы, тем больше нужно кислот, чтобы снизить pH корма, т. е. более буферный материал связывает, нейтрализует часть молочной кислоты (ионы водорода). Поэтому, несмотря на накопление кислоты, pH среды почти ие снижается до тех пор, пока не израсходован весь материал, обеспечивающий буферность. Связанные буферным материалом кислоты образуют в силосе-запас так называемых связанных кислот. Более буферное исходное сырье для получения силоса хорошего качества должно иметь больше сахаров, чем менее буферное. Таким образом, силосуемость растений определяется также специфическими буферными свойствами.
Буферность растительной массы определяют титро-" ванием растертой растительной массы 0,1 н. раствором молочной кислоты до pH 4,0. Выясняют, сколько потре-буется молочной кислоты для смещения pH до 4,0. Поскольку для образования молочной кислоты затрачивается примерно 60% сахаров корма, то, рассчитав 100%, определяют так называемый сахарный минимум для данного растительного сырья, т. е. наименьшее количество сахара, необходимое для образования такого количества молочной и уксусной кислот, чтобы сместить pHДо 4,0.
Растения хорошо силосуются, если в них много са-хара, а сахарный минимум небольшой. Если фактичес-
кое содержание сахара в растениях примерно равняет і ся сахарному минимуму, то они силосуются плохо и малейшее оФклонение в процессе силосования приведет к порче силоса. Если фактическое содержание сахара меньше- сахарного минимума, то такие растения ие силосуются.
При силосовании сохраняются цветки и листья, содержащие наибольшее количество питательных веществ. Потери сухих веществ при правильном силосовании не превышают 10-15%. Хороший силос характеризуется следующими показателями: цвет - оливково-зеленый
(лишь несколько изменяется), запах - приятный (моченых яблок, печеного хлеба), pH 4-4,2, общая кислотность 2-2,5% (в переводе на молочную кислоту), влажность- 70%. Микрофлора хорошего силоса представлена молочнокислыми палочками и молочнокислыми стрептококками, часто в небольших количествах встречаются дрожжи. Последние образуют эфиры, придающие силосу приятный запах и обогащающие корм белком и витаминами. Однако в больших количествах дрожжи ухудшают качество силоса - они снижают его кислотность, так как являются конкурентами с молочнокислыми бактериями в потреблении сахара.
В первый период после закладки силоса бурно развивается микрофлора смешанной фазы брожения, обычно представленная на поверхности здоровых растений: гнилостные бактерии (в основном неспорообразующие палочки), бактерии группы кишечной палочки, маслянокислые бактерии и др. При подкисЛении корма их сменяют молочнокислые стрептококки, а затем более кислотоустойчивые молочнокислые палочки. Через две недели (при снижении pH до 4,0 и ниже) микробиологические процессы в силосе в основном заканчиваются.
Для анализа из торцовой части траншеи, ям или наземных буртов берут среднюю пробу силоса. Для этого, сняв стерильным ножом верхний слой, вырезают кубики по средней линии бурта, с интервалом в 1 м. Их складывают в стерильную стеклянную банку емкостью 1-2 л с притертой пробкой так, чтобы силос был уложен плотно и доверху. Пробы перемешивают в стерильном кристаллизаторе, измельчают стерильными ножницами и берут навески для анализов.
Исследование рекомендуется проводить не позднее суток после взятия пробы.
Микроскопическое исследование микрофлоры силоса
Для знакомства с микрофлорой силоса из него гото> вят препарат следующим образом. Берут пинцетом силос и плотно прижимают его к предметному стеклу без добавления воды, стараясь, чтобы на стекле остался отпечаток. Препарат сушат на воздухе, фиксируют на пламени и окрашивают метиленовым синим (2-3 мин). Смыв краситель водопроводной водой и высушив вдали от пламени, микроскопируют с иммерсионной системой.
На препарате выявляются тонкие неспорообразующие палочки, варьирующие в размере (молочнокислые бактерии) и молочнокислые стрептококки. Среди них обычно преобладают Lactobacterium plantarum- го- моферментативные мезофильные" короткие палочки, часто располагающиеся параллельными рядами. Иногда встречаются клетки почкующихся дрожжей. Споровые формы бактерий наблюдаются редко. В плохом силосе выявляются спорообразующие палочки (маслянокислые бактерии, аэробные гнилостные бактерии), а также плесневые грибы.
Количественный учет микроорганизмов в силосе
Навеску силоса 5 г помещают в колбу с 50 мл стерильной водопроводной воды и 2-3 г песка. Колбу взбалтывают круговыми вращательными движениями в течение 10 мин. Из полученной вытяжки готовят последующие разведения (10-2; 10+ 10+ 10+ 10~6), а затем высевают из соответствующих разведений на элективные среды по 1 мл суспензии при глубинном посеве, по 0,05 мл суспензии при поверхностном посеве. Посевы выдерживают при температуре 28°С.
Определение количества молочнокислых бактерий проводят на сусло-агаре с мелом или капустном агаре с мелом (среды 1, 1а), а также на капустном агаре со спиртом и мелом (среда 2) - глубинный посев. Вокруг колоний молочнокислых бактерий вследствие накопления молочной кислоты образуются зоны растворения мела (рис. 37).
Подсчет колоний молочнокислых бактерий на сусло- агаре с мелом и капустном агаре с мелом проводят на
6-й день, а на капустном "агаре со спиртом и мелом- на 7-10-й день. Среда 2 необходима для выявления молочнокислых бактерий в составе эпифитной микрофлоры исходной растительной массы, так как спирт тормозит рост посторонней микрофлоры. Количество посторонней микрофлоры (аэробных гнилостных микроорганизмов) определяют глубинным посевом на пеп- тонном агаре (среда 3). Подсчет колоний ведется на 5-

Рис. 37. Зоны растворения мела вокруг колоний молочнокислых бактерий силоса.
7-й день.
Количество микроскопических грибов и дрожжей определяется на сусло-агаре со стрептомицином (среда 4) поверхностным посевом. Подсчет колоний ведется на 3-4-й день (при необходимости повторно на 7-8-й день).
Титр маслянокислых бактерий устанавливают на жидкой среде Емцева (среда 5а) и картофельной среде (среда 5). Для определения количества спор мясляно- кислых бактерий ведется посев из суспензии, после пастеризации в течение 10 мин при 75°С. Учет результатов анализа ведется по интенсивности выделения газа (кусочки картофеля всплывают на поверхность жидкости), и титр маслянокислых бактерий и их спор устанавливают методом предельных разведений по Мак- Креди.
Аэробные протеолитические бактерии учитывают на мясо-пептонном бульоне (среда 6) по накоплению газа в поплавках. Посевы выдерживают при 28°С в течение двух недель.
При анализе силосов из трав, выращенных по фону высоких доз азотных удобрений, проводится также учет денитрифицирующих бактерий на среде Гильтая (среда 7). Посевы выдерживают в течение 10-12 дней при 28°С. Подсчет денитрификаторов ведется по интенсивности выделения газа и изменению цвета индикатора.
При анализе силоса ведется также учет спор аэробных гнилостных бацилл. На плотной среде (среда 8)
делают поверхностный посев. Чашки инкубируют при 28°С, подсчет колоний проводят на 4-й день.
Бактерии группы кишечной палочки учитывают на среде Кесслера или Булира по выделению газа и накоплению его в поплавках. Пробирки выдерживают 48 ч при 40-42°С.
Состав элективных сред
Среда 1. Сусло-агар с мелом. Сусло, разбавленное до 3% по Еаллингу,- 1 л, агар - 20-25 г, стерильный мел - 30 г. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин.
Среда 1а. Капустный агар с мелом. Капустный бульон - 900 мл, дрожжевой экстракт-100 мл, пептон-10 г, глюкоза - 20 г, ацетат натрия - 3,35 г, марганец сернокислый - 0,025 г, агар - 15-20 г.
Стерильный мел добавляют в колбы из расчета 5 г на 200 мл среды. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин.
Среда 2. Капустный агар со спиртом и мелом. В расплавленную н охлажденную до 50° С среду прибавляют 20 мл этилового спирта (96%-ного) на 200 мл среды, тщательно взбалтывают и заливают в чашки Петри с посевным материалом.
Среда 3. Пептонный агар. . Пептон - 5 г, К2НРО4 - 1 г, . КН2РО4 - 0,5 г, MgSOi - 0,5 г, NaCl - следы, водопроводная вода - 1 л, агар, хорошо промытый, - 15-20 г. Стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.
Среда 4. Сусло-агар со стрептомицином. Сусло, разбавленное до 3% по Баллингу,- 1 л, агар - 25 г. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Перед разливкой среды в чашки Петри в сусло-агао добавляют 80-100 ед. стрептомицина на каждый миллилитр среды.
Среда 4а. Подкисленный сусло-агар. Сусло, разбавленное до 3% по Баллингу,- 1 л, агар - 20-25 г. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Перед разливом среды в чашки Петри в расплавленный сусло-агар добавляют 2 мл молочной кислоты (на 1 л среды), прокипяченной в течение 10 мин иа водяной бане.
Среда 5. Картофельная среда с мелом. В пробирки вносят стерильный мел (на кончике скальпеля), 8-10 картофельных кубиков величиной 2-3 мм заливают водопроводной водой до s/4объема- пробирок. Стерилизуют при 1 атм в течение 30 мин.
Среда 5а. Картофельный крахмал - 20 г, пептон - 5 г, дрожжевой автолизат - 0,2 мг/л, КН2Р04- 0,5 г, К2НРО4 - 0,5 г, MgSC>4- 0,5 г, NaCl - 0,5 г, FeS04- 0,01 г, MnS04- 0;01 г, СаС03- 10 г, смесь микроэлементов no М. В. Федорову-1 мл, дистиллированная вода--1 л, тногликолевая кислота - 0,05%, нейтральрот - 0,004%) pH 7,4-7,5. Стерилизация среды осуществляется при- 0,5 атм в течение 30 мин. Температура инкубации посевов 30-35° С.
Среда 6. Мясо-пептонный бульон. Пептон - 10 г, NaCl - 4 г, мясной бульон - 1л. Наливают в пробирки с поплавками до 3/« объема. Стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин.
Среда 7. Среда Гильтая (видоизмененная). Лимоннокислый нат-рий-2 г, KNO3- 1 г, КН2Р04- 1 г, К2НР04- 1 г, MgS04 -
1 г, СаС12 - 0,2 г, FeCl3- следы, дистиллированная вода - 1 л,
1 %-йьгй раствор бромтимолблау (pH 6,8-7,0). Стерилизуют прн 1 атм в течение 20 мин.
Среда 8. Мясо-пептонный агар и сусло-агар 1: 1. Стерилизуют при. 0,5 атм в течение 30 мин.
Среда 9. Среда Кесслера. К 1 л водопроводной воды прибавляют 50 мл свежей бычьей желчи и 10 г пептона. Смесь кипятят 15 мин на водяной баие, взбалтывают. Когда пептои растворится, фильтруют через вату, затем прибавляют 10 г лактозы. После растворения лактозы устанавливают слабощелочную реакцию (pH 7,6) и добавляют 4 мл 1%-ного водного раствора генциана фиолетового из расчета 1 г сухой краски на 25 л среды. Жидкость разливают в пробирки с поплавками"и стерилизуют при 1 атм в течение 15 мии.
Среда 10. Среда Булира. Кіл мясо-пептонного бульона добавляют 12,5 г маннита и 6 мл 1%-ного раствора нейтральрота. Среду разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Среда имеет вишневый цвет, при развитии кишечной палочки становится оранжевой и в поплавке скапливается газ.
Доминирующие на плотных средах колонии микроскопируют. Для обнаружения маслянокислых бактерий из пробирок с картофелем готовят препарат в раздавленной капле с добавлением раствора Люголя.
Определение кислотности
Определение общей кислотности в силосе. Берут навеску силоса 20 г и помещают в коническую колбу с обратным холодильником емкостью 500 мл. Содержимое колбы заливают 200 мл дистиллированной воды, тща-тельно перемешивают и нагревают в течение 1 ч. После охлаждения содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр и 10 мл фильтрата (с двойным количеством дистиллированной воды) оттитровывают 0,1 н. раствором едкого натра в присутствии фенолфталеина до появления устойчивой слабо-розовой окраски.
Общее содержание кислоты в силосе в переводе на молочную выражают в процентах. 1 мл 0,1 н. раствора NaOH соответствует 0,009 г молочной кислоты. Умножив количество 0,1 н. NaOH, израсходованного на титрование экстракта из 100-г силоса, на 0,009, находят количество кислоты в силосе(%).
Пример расчета. На титрование 10 мл вытяжки израсходовано 1,7 мл 0,1 н. NaOH, следовательно, на 200 мл пойдет 34 мл 0,1 н. NaOH.
200 мл вытяжки получены из 20 г силоса, а для нейтрализации 100 г силоса будет израсходовано X мл 0,1 н. NaOH:
100.34
Х= --¦ =170 мл 0,1 и. NaOH.
Умножив 170 на 0,009, получим содержание молочной кислоты в процентах:
170 X0,009=1,53%
Достаточно точные результаты получаются и в том случае, если определение кислотности ведут следующим образом. Берут навеску силоса 5 г, растирают в ступке и помещают в широкую пробирку (диаметром 2-
см). Содержимое заливают 50 мл дистиллированной воды, закрывают резиновой пробкой и тщательно перемешивают. Навеску силоса настаивают при 10-12°С в:‘ течение 30 мин, а затем определяют кислотность вытяжки титрованием. 10 мл вытяжки (с двойным количеством дистиллированной воды) оттитровывают 0,1 и. раствором едкого натра в присутствии фенолфталеина до появления устойчивой слабо-розовой окраски.
Пример расчета. На титрование 10 мл вытяжки израсходовано 1,7 мл 0,1 н. NaOH, следовательно, на 50 мл вытяжки-
мл; 50 мл вытяжки получены из 5 г силоса, а для нейтрализации 100 г силоса будет израсходовано X мл 0,1 н. NaOH:
100.8,5
Х=L = 170 мл 0,1 н. NaOH;
5
170 X0,009 = 1,53% молочной кислоты.
Определение pH в силосе. Приготовление вытяжки силоса для определения в нем pH проводят так же, как для определения общей кислотности в силосе. pH нахо-дят с помощью индикаторов или электрометрического определения. При использовании индикаторов поступают следующим образом. В фарфоровую чашку берут 2 мл вытяжки силоса и добавляют 2 капли индикатора (смесь равных объемов бромтимолблау и метилрота). Сравнивая цвет содержимого чашки с данными, приведенными ниже, определяют концентрацию водородных ионов. Цвет индикатора pH Красный 4,2 и ниже Красно-оранжевый 4,2-4,6 Оранжевый 4,6-5,2 Желтый 5,2-6,1 Желто-зеленый 6,1-6,4 Зеленый 6,4-7,2 Зелено-синий 7,2-7,6 Материалы и оборудование. Весы и разновесы, конические колбы емкостью 500 мл с обратным холодильником, широкие пробирки, треножник с асбестовыми сетками, колбы емкостью 100 мл и 250 мл, воронки, бумажные фильтры, пипетки на 10 мл и 2 мл, фарфоровые чашки, пинцеты; индикаторы: смесь равных объемов бромтимолблау и метилрота, фенолфталеин, метиленовый синий, раствор Люголя (1:2).
Питательные среды, стерильные чашки Петри, стерильные пипетки на 1 мл, стерильная водопроводная вода в пробирках по 9 мл и в колбах - по 50 мл. Чашки и пробирки с посевами. Микроскоп и все необходимое для микроскопирования.
ДРОЖЖЕВАНИЕ КОРМА
Дрожжи содержат много легкопереваримого белка, богаты эргостерином, легко переходящим в витамин D, витаминами А, В, Е; энергично размножаются, неприхотливы к среде обитания, их можно легко выращивать на отходах сельского хозяйства и промышленности. Кормовые дрожжи в настоящее время готовят в больших количествах, размножая их на производственных отходах, в том числе растительных гидролизатах (солома, древесные отходы и т. д.). Сейчас найдены дрожжи (Candida),хорошо размножающиеся на углеводородах. Это дает возможность готовить дешевые кормовые дрожжи на отходах нефтяной промышленности. Помимо добавления в кормовой рацион сухих дрожжей, применяют дрожжевание корма. Для этого в измельченную и увлажненную растительную массу вносят культуру дрожжей. Периодически перемешивают. Дрожжи обильно размножаются в корме, что обычно совпадает с его подкислением. Однако накопление кислот объяс-няется развитием молочнокислых бактерий, всегда обитающих на растительной массе. Для активного размножения дрожжей в кормах необходим ряд условий: хорошо подготовленная питательная среда (измельчен- ность, влажность, температура 25-27°С, достаточная аэрация, pH среды 3,8-4,2). Дрожжевать можно лишь корма, богатые моно- и дисахаридами. В противном случае дрожжи и молочнокислые бактерии развиваться не будут. Помимо концентратов, дрожжеванию подвергают сочные корма, к которым примешивают грубые корма.
При дрожжевании концентрированных кормов теряется 5-6% сухих веществ. Эти потери падают главным образом на углеводы, сбраживаемые дрожжами.
При дрожжевании кормов представляет интерес воз-можность обогащения корма белком за счет вносимого минерального азота. Дрожжи, потребляя соли аммония, обогащают субстрат белком на 13-17% (в расчете на сухое вещество). Дрожжевание делает корм приятнокислым, обогащает его витаминами, возбуждает у животных аппетит, устраняет многие заболевания (паратифозные инфекции, рахит молодняка, поражения кожи и другие болезни), благоприятно влияет на продукцию молока у коров, яйценоскость птицы, увеличение приве- са у животных. |
В лабораторной практике дрожжевание корма мож- * но провести на свекле, которую предварительно наре- зают мелкими кусочками, или на отрубях. Корм вносят в тарированный химический стакан емкостью 100 мл со стеклянной палочкой, увлажняют в случае отрубей до консистенции густой сметаны. Стаканы с кормом взвешивают. Масса увлажненного корма должна быть около 100 г. В качестве закваски используют однодневную разводку пекарских дрожжей на сусле в количест-¦ ве 5% (на 100 г корма вносят 5 мл суспензии дрожжей).
Корм тщательно перемешивают стеклянной палочкой, стакан накрывают бумажной этикеткой, на которой записывают тару стакана и массу увлажненного корма" (без закваски).
Дрожжеванные корма оставляют при комнатной тем-пературе, перемешивая содержимое стакана несколько раз в день.
Через 1-2 дня определяют количество дрожжевых ‘ клеток в корме.
Учет дрожжевых клеток в суспензии дрожжей (закваске)
" методом прямого их счета под микроскопом
Берут петлей определенное количество дрожжевой закваски (1 петля захватывает 0,01 мл), наносят на предметное стекло, добавляют столько же молока и размазывают на определенной площади (4 см2). Препарат сушат на воздухе, осторожно фиксируют на пламени и окрашивают метиленовым синим в течение 10 мин.
Под микроскопом с иммерсионной системой подсчитывают количество дрожжевых клеток (в 10 ПОЛЯХ
зрения). Количество дрожжевых клеток в 1 мл закваски определяют по формуле:
S
-А. 100,
Si
гдеА - среднее количество дрожжевых клеток в одном поле зрения;
S- площадь квадрата (4 с.м2);
Si- площадь поля зрения,
Si=jrr2,
где г - радиус объектива, определяемый с помощью объектного микрометра. На объектный микрометр наносят каплю кедрового масла н с иммерсионной системой определяют иа линейке объектного микрометра радиус объектива.
Если г объектива « 0,08 мм, то
S,=3,14.0,0064=0,02 мм2,
S 400 мм2
=20000.
Si 0,02 мм2
Учет дрожжевых клеток в дрсжжеванном корме
Через 1-2 дня стаканы с дрожжеванным кормом взвешивают. Вследствие сбраживания сахара и испарения воды масса корма становится меньше. Берут среднюю пробу в количестве 10 г, вносят в колбу, содержащую 100 мл стерильной водопроводной воды, и взбалтывают в течение 5 мин. Затем на определенной площади предметного стекла (4 см2) размазывают определенный объем суспензии (0,01" мл-1 петля) и добавляют 0,01 мл молока. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют осторожно на пламени, красят метиленовым синим в течение 10 мин. Подсчитывают количество дрожжевых клеток в одном поле зрения (10 полей зрения).
Среднее количество клеток в одном поле зрения умножают на 20 000, на 100 и 10, получают количество клеток в 1 г корма. Затем эту цифру умножают на массу корма и определяют число дрожжей во всем корме.
Чтобы узнать, во сколько раз увеличилось количество дрожжей в процессе дрожжевания корма, надо разделить их число на первоначальное количество дрожжевых клеток, содержащихся в закваске. Корм считается хорошим, если в одном поле зрения встречается не более 10 посторонних бактериальных клеток (не дрожжей).
Материалы и оборудование. Весы н разновесы, стаканы на 100 мл со стеклянными палочками, свекла, отруби, суспензия дрожжей, градуированные пипетки на 5-10 мл, петли, молоко в пробирках, предметные стекла с квадратом 4 см2 из миллиметровой бумаги, объектный микрометр, индикатор метиленовый синий, стаканы с дрожжеванным кормом. Микроскоп и все необходимое для микроско- пирования.

Занятие 4 МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОРМОВ

Цель занятия. Ознакомиться с методами санитарно-микробиологического анализа кормов.

Материалы и оборудование. Лабораторные весы; термостат; шуттель-аппарат; эксикатор; стерильные пробирки; пипетки; чашки Петри; фарфоровые ступки; ватно-марлевые фильтры; питательные среды (мясо-пептонные бульон, агар, желатин, лептонная вода, висмут-сульфит-агар, селенитовый бульон, магниевая среда, среды с мочевиной, глюкозой и сернокислым железом, углеводами и индикатором Андраде в сочетании с тимоловым синим, цитратноаммонийная среда, мясо-пептонный желатин, среды Вильсона- Блера, Киллиана, Китта-Тароцци, Кларка, Левина, Плоскирева, Ресселя, Эндо, Эйкмана, кровяной агар по Цейслеру, бульон Хот- тингера, молоко, печеночный бульон); физиологический раствор; индикаторные бумажки; лабораторные животные (белые мыши, морские свинки).

Общие сведения. От каждой партии корма отбирают две средние пробы массой не менее 500 г. Одну направляют в лабораторию, другую сохраняют в хозяйстве до окончания исследования. Для упаковки проб используют стерильную пластмассовую или стеклянную тару.

В пробах корма определяют общую микробную обсемененность, содержание сальмонелл, энтеропатогенных типов кишечной палочки, анаэробов.

Содержание занятия. Определение микробной обсемененности. В стерильную пробирку помещают 1 г корма, взятого из средней пробы, добавляют 9 мл физиологического раствора и тщательно встряхивают (получают разведение 1: 10). Из взвеси готовят последующие разведения (1: 100, 1: 1000, 1: 10 000 и т. д.). После осаждения взвешенных частиц для посевов берут жидкость из верхнего слоя.

Для количественного учета микробов в стерильные чашки Петри вносят по 1 мл из пробирок с разным разведением и доливают 10- 15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44-45 °С мясо-пептонного агара (МПА). Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 37 "С на 24-48 ч. После этого подсчитывают выросшие колонии. Полученные результаты умножают на степень разведения, суммируют и определяют количество микробов в 1 г корма.

Пример расчета. В первой чашке обнаружено 200 колоний, во второй - 21, в третьей - 1. В эти чашки посевной материал брали из пробирок с разведениями соответственно 1: 10 000,1:100 000,1:1000 000. Следовательно, в 1 г корма будет содержаться

Микробную обремененность мясо-костной муки можно определить экспресс-методом с применением резазурина. Для этого в одну стерильную пробирку помещают 1 г средней пробы мясо-костной муки, добавляют 10 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) и встряхивают, а вдругую пробирку (для контроля) вносят только 10 мл МПБ. Пробирки помещают в термостат при 40 "С на 3 ч. После этого в них добавляют по 1 мл 0,01%-ного раствора резазурина и вновь выдерживают в термостате в течение 2 ч.

Результаты реакций учитывают через каждые 30 мин. По восстановлению резазурина (изменению окраски из синей в розовую) определяют общую микробную обсемененность мясо-костной муки. Если в пробирке с мясо-костной мукой розовое окрашивание наступает позднее чем через 2 ч, то это говорит о том, что в 1 г продукта содержится до 500 тыс. микробов, а при окрашивании в розовый цвет до 2ч - более 500 тыс. микробов.

Контролем служит пробирка с 10 мл МПБ и 1 мл 0,01 %-ного раствора резазурина, выдержанная в термостате при том же температурном режиме и экспозиции и без изменения цвета содержимого.

Исследование на сальмонелл ы. Для анализа берут 50- 200 г исследуемого корма, измельчают его в стерильной фарфоровой ступке и переносят в колбу со средой предварительного обогащения (пептонная вода, МПБ с содержанием 5 % маннита) при соотношении материала и среды 1:5. Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 16-18 ч материал высевают в чашки Петри на твердые дифференциально-диагностические среды (висмут-сульфит-агар, среда Плоскирева или Левина) и на две основные среды обогащения (селенитовый бульон, среда Киллиана в соотношении 1:1).

После 16-18 ч выдержки в термостате при 37 °С из сред обогащения делают вторично посевы в чашки с висмут-сульфит-агаром и в чашки со средами Плоскирева и Левина (по выбору) и ставят их в термостат при 37 °С.

Чашки просматривают через 16-24 и 48 ч.

На висмут-сульфит-агаре S. typhi и S.paratyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром, S. cholerae suis - в виде зеленых колоний. Колонии всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета, с металлическим блеском, окруженные светлым ореолом, участок среды под колонией черный. На среде Плоскирева вырастают прозрачные или нежно-розовые колонии, на среде Левина - прозрачные, бледные, нежно-розовые или розовато-фиолетовые.

В случае обнаружения колоний, похожих на сальмонеллы, 3-5 из них высевают на комбинированную среду Ресселя или скошенный агар с мочевиной и бульон Хотгингера для определения индола и сероводорода (под пробирки с бульоном подкладывают специальные индикаторные бумажки). Для определения подвижности культуры делают посев уколом в полужидкий агар (0,3-0,5%-ный).

На среду Ресселя и скошенный агар посевы делают сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. Если разлагается мочевина в скошенном агаре, то окраска среды меняется на оранжевую при индикаторе BP и на коричнево-фиолетовую при индикаторе тимоловый синий в сочетании с индикато-ром Андраде.

Морфологию культуры изучают в мазках, окрашенных по Граму, и подвижность - в висячей или раздавленной капле или полужидком агаре. Культуры, представляющие грамотрицательные подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, исследуют серологически - испытывают в реакции агглютинации (РА) на предметном стекле с набором агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной О-сыворотки (группы, А, В, С, D, Е).

Для РА с О-сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н-сыворотками - из нижней части (конденсационной воды), где микробы наиболее подвижны. По групповой О-сыворотке устанавливают принадлежность культур к той или иной серологической группе.

Исследования на энтеропатогенные типы кишечной палочки. 50 г корма помещают в колбу, содержащую 500 мл стерильного физиологического раствора, встряхивают на шуггель-аппарате в течение 20 мин. Из полученной взвеси стерильными пипетками готовят разведения 1: 100, 1: 1000, 1: 10 000, 1: 100 000, 1: 1 000 000. По 1 мл каждого разведения вносят в пробирки со средой Эйкмана. Посевы помешают в термостат при температуре 43 °С. Через 24 ч учитывают рост по помутнению среды и образованию газа. Титр кишечной палочки устанавливают по наи-большему разведению, в котором еще наблюдался ее рост.

Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев на плотные дифференциальные среды (Эндо, Левина, Плоскирева), разделенные на секторы для каждого разведения.

Типичные колонии Е. coli круглой формы, гладкие, выпуклые или слегка приподнятые в центре с ровными краями розового, красного или малинового цвета, с металлическим блеском или без него на среде Эндо или черного цвета на среде Левина.

Выросшие изолированные колонии S-формы (не менее 4) пересевают на МПБ, выдерживают в термостате при температуре 37 °С в течение 16-24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посевов на дифференциальные диагностические среды, заражения мышей; вторую - для приготовления автоклавированного антигена, если кипяченый антиген не будет агглютинироваться поливалентными (комплексными) коли-сыворотками.

У выделенных культур определяют морфологические и культу-рально-биохимические свойства для установления их родовой принадлежности. Морфологию бактерий изучают в мазках, окрашенных по Граму, их подвижность определяют по характеру роста в 0,3%-ном полужидком МПА.

Для определения культурально-биохимических свойств бактерий используют набор питательных сред (с углеводами и индикатором Андраде, цитратно-аммонийную, мясо-пептонный желатин, МПБ или бульон Хоттингера и агар с глюкозой и сернокислым железом).

Патогенные свойства кишечной палочки определяют путем постановки биологической пробы на белых мышах. Для этого трем мышам массой 14-16 г внутрибрюшинно вводят смывы с суточных агаровых культур в дозе 500 млн микробов. Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более мышей в первые 4 сут после заражения.

Исследования на анаэ р об ы. 50 г корма растирают в стерильной ступке, разводят физиологическим раствором и засевают в несколько пробирок со средой Китга-Тароцци, Вильсона-Блера, молоком и в две чашки со средами и кровяным агаром по Цейслеру. Для уничтожения вегетативных форм микробов по одной пробирке с жидкими средами нагревают при температуре 80 °С в течение 20 мин. Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С. Чашки должны находиться в специальных аппаратах для анаэробных культур или в эксикаторе, куда заранее вносят тот или иной погло-титель кислорода.

Результаты посевов регистрируют в тот же день. Почернение среды Вильсона-Блера в течение 1 -3 ч после посева, свертывание молока с образованием ноздревато-губчатого сгустка и прозрачной сыворотки в течение 6 ч, а также быстрое начало роста на среде Китта-Тароцци (через 4-5 ч) при обильном газообразовании - характерные признаки присутствия возбудителей Cl. perfringens.

Рост CI. botulinum, наблюдаемый обычно на 2-3 сут, характеризуется помутнением среды Китта-Тароцци, образованием осадка и появлением запаха прогорклого масла.

При обнаружении роста на среде Китта-Тароцци проводят микроскопическое исследование и выделение чистой культуры посевом в 2-3 чашки с кровяным агаром по Цейслеру. Последние выдерживают в анаэробных условиях при температуре 37 °С в течение 24- 48 ч, после чего просматривают рост в чашках и отбирают культуры, которые классифицируют по морфологическим и биохимическим свойствам.

Биологическую пробу ставят на морских свинках или белых мышах, вводя внутрибрюшинно бульонную культуру. При положительном результате подопытные животные погибают через 12-48 ч.

Для идентификации отдельных возбудителей или типов одного вида проводят опыт нейтрализации токсина со специальной сывороткой. Для этого минимальную смертельную дозу культуры в смеси с 0,2-0,5 мл соответствующей типоспецифической сыворотки выдер-живают в термостате 45 мин и вводят мышам внутрибрюшинно. Для контроля испытуемую культуру или фильтрат применяют без сыворотки. Вид и тип микроба определяют по выживаемости мышей.

При исследовании кормов на ботулизм (наличие токсинов) в качестве подопытных животных используют белых мышей. При этом могут быть применены два способа:

а) нейтрализация токсина противоботулиновой сывороткой (антитоксином). Корм предварительно растирают в стерильной ступке, добавляют физиологический раствор (1: 4) и настаивают в течение 1 -2 ч при комнатной температуре. После этого настой центрифугируют и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. КО,5 мл фильтрата добавляют 0,2 мл поливалентной противоботулиновой сыворотки. Смесь выдерживают 1 ч при комнатной температуре, затем одному животному вводят подкожно 0,5 мл фильтрата, другому - смесь фильтрата с сывороткой в той же дозе.

Аналогичные испытания могут быть проведены чистой культурой, выращенной (в течение 6-7сут) на печеночном бульоне. В этом случае пастеровской пипеткой отсасывают верхний слой культуры и пропускают через ватно-марлевый фильтр. Далее поступают, как указано выше;

б) разрушение токсина кипячением фильтрата. Фильтрат готовят, как указано в подпункте «а». Одну половину фильтрата кипятят в течение 30 мин. Затем одному животному внутрибрюшинно вводят 0,5-1 мл некипяченого фильтрата, другому - такую же дозу кипяченого.

Положительным результатом биологической пробы по первому и второму способам считают гибель мышей, наступившую как от фильтрата, не обработанного противоботулиновой сывороткой, так и от некипяченого фильтрата.

ГОСТ Р 51426-99
(ИСО 6887-83)

Группа С19

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

МИКРОБИОЛОГИЯ. КОРМА, КОМБИКОРМА, КОМБИКОРМОВОЕ СЫРЬЕ

Общее руководство по приготовлению разведений для микробиологических исследований

Microbiology. Feedstuffs, compound feeds, feed raw materials. General guidance for the preparation of dilutions for microbiological examination

Текст Сравнения ГОСТ Р 51426-2016 с ГОСТ Р 51426-99 см. по ссылке .
- Примечание изготовителя базы данных.
____________________________________________________________________

ОКС 65.120
ОКСТУ 9209, 9709

Дата введения 2001-01-01

Предисловие

1 РАЗРАБОТАН творческим коллективом с участием представителей Технического комитета по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"

ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 4 "Комбикорма, белково-витаминные добавки, премиксы"

2 ПРИНЯТ И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Госстандарта России от 22 декабря 1999 г. N 581-ст

3 Настоящий стандарт представляет собой аутентичный текст международного стандарта ИСО 6887-83* "Микробиология. Общее руководство по приготовлению разведений для микробиологических исследований", за исключением наименования, 1, 2, 7
________________
* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым здесь и далее по тексту, можно получить перейдя по ссылке на сайт http://shop.cntd.ru . - Примечание изготовителя базы данных.

4 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

5 ПЕРЕИЗДАНИЕ

1 Область применения

1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на корма, комбикорма, комбикормовое сырье и представляет собой общее руководство по приготовлению разведений для выявления наличия (отсутствия) или определения количества аэробных микроорганизмов (в настоящее время руководство должно использоваться в сочетании с методами, описанными в "Правилах бактериологического исследования кормов").

Обязательные требования к порядку проведения разведений изложены в разделе 9.

2 Нормативные ссылки

ГОСТ 13496.0-80 * Комбикорма, сырье. Методы отбора проб
_______________
* Действует до введения в действие ГОСТ Р, разработанного на основе ИСО 6497 .


ГОСТ Р 51419-99 (ИСО 6498-98) Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Подготовка испытуемых проб

3 Определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

исходная суспензия (первичное разведение): Суспензия, раствор или эмульсия, полученные после того, как взвешенное или измеренное количество исследуемого продукта было смешано, если это необходимо, с использованием смесителя и соблюдением соответствующих предосторожностей (см. примечание к 9) с девятикратным количеством жидкости для разведения (разбавитель см. 5) так, чтобы крупные частицы, если они есть, могли осесть.

Примечание - В некоторых случаях, в особенности для продуктов, у которых исходная 1+9 суспензия слишком вязкая или слишком густая, необходимо прибавить больше разбавителя. Это следует учитывать в последующих действиях и при представлении результатов;


дальнейшие десятикратные разведения: Суспензии или растворы, полученные путем смешивания определенного объема исходной суспензии с девятикратным объемом разбавителя и повторения этой процедуры до тех пор, пока не будет получена серия десятикратных разведений, пригодных для инокуляции культуральной среды;

специальный стандарт: Стандарт или официальное руководство, описывающие исследование конкретного продукта (или группы продуктов) на идентификацию или количественный подсчет определенного микроорганизма (или группы микроорганизмов) и описывающие особенности отбора и приготовления испытуемых проб.

4 Сущность метода

Сущность метода заключается в приготовлении исходной суспензии с равномерным, насколько это возможно для испытуемой пробы, распределением микроорганизмов. При необходимости, для того, чтобы снизить количество микроорганизмов на единицу объема и сделать возможным после инкубации наблюдение за их ростом или подсчет колоний, готовят десятикратные разведения.

Приемлемое количество микроорганизмов обычно составляет:

- для наиболее вероятного метода подсчета с использованием трех пробирок: 1 микроорганизм в 10 см самого высокого десятикратного разведения;

- для метода подсчета колоний: от 30 до 300 колоний (для некоторых групп, например, колиформ от 15 до 150 колоний).

5 Разбавитель

5.1 Чтобы добиться воспроизводимости результатов, для приготовления разбавителя следует использовать обезвоженные основные компоненты или обезвоженный полноценный препарат.

Следует строго соблюдать инструкции изготовителя.

Все реактивы должны быть квалификации х.ч. или ч.д.а.

Используемая вода должна быть дистиллированной в стеклянном аппарате или деионизированной.

5.2 Состав

Если нет неопровержимых доказательств (например, авторитетных данных или сравнительных опытов), что другие разбавители более приемлемы для данных продуктов, то следует использовать разбавитель следующего состава: 1,0 г пептона, 8,5 г хлористого натрия, 1 дм воды.

5.3 Приготовление

Компоненты растворяют в воде, если это необходимо, с подогревом.

рН разбавителя после стерилизации должен быть равен 7,0 при 25°С.

5.4 Распределение разбавителя

Разбавитель помещают в пробирки, колбы или флаконы соответствующей вместимости в таком количестве, чтобы после стерилизации каждая из них содержала 9 см разбавителя или объем, кратный 9 см (для десятикратных разведений), или 90 см разбавителя, или объем, кратный 90 см (для исходной суспензии). В случае нежидких продуктов см. 9.1.2. Закрывают пробирки, колбы или флаконы пробками.

Пробирки, колбы или флаконы с разбавителем стерилизуют в автоклаве при (121±1)°С в течение 20 мин.

Если разбавитель не используют сразу, его следует хранить в темноте при температуре от 0 до 5°С не более одного месяца в условиях, не допускающих никаких изменений в его объеме или составе.

Примечание - При подсчете нескольких групп микроорганизмов, нуждающихся в различных культуральных средах, необходимо распределить все разведения (или некоторые из них) в количествах, превышающих 9 см. Вместимость пробирок, колб или флаконов должна быть соответственно указана.

6 Оборудование

Для проведения испытаний применяют обычное микробиологическое оборудование.

6.1 Прибор для сухой или влажной стерилизации (печь или автоклав, работающий отдельно или как часть прибора для приготовления и распределения сред).

Прибор, который будет входить в контакт с разбавителем, пробой или разведениями, кроме оборудования, которое поставляют стерильным (пластиковые чашки, пластиковые пипетки и т.д.), следует стерилизовать по одному из следующих методов:

- путем выдерживания в печи при 170-175°С в течение 1 ч;

- путем выдерживания в автоклаве при (121±1)°С в течение 20 мин.

6.2 Оборудование для встряхивания (для нежидких продуктов см. 9.1.2).

Допускается использовать один из следующих приборов:

- вращательный встряхиватель, устойчивый к условиям стерилизации, работающий частотой вращения от 8000 до 45000 об/мин со стеклянными или металлическими резервуарами, снабженными крышечками;

- встряхиватель перистальтического типа (стомахер) со стерильными пластиковыми емкостями.

Примечание - Резервуары или пластиковые емкости должны быть достаточной вместимости, позволяющей пробе эффективно перемешиваться с достаточным количеством разбавителя. Как правило, вместимость контейнера должна в два раза превышать объем пробы плюс разбавитель.

6.3 Смеситель, способный перемешивать 1 или 2 см пробы (в случае жидких продуктов) или ее более высокое разведение в пробирке соответствующей вместимости с 9 или 18 см разбавителя для получения гомогенной суспензии, работающий по принципу эксцентрического вращения содержимого пробирки (смеситель Вортекса).

6.4 Колбы или флаконы вместимостью, достаточной для того, чтобы поместить 90 см разбавителя, используемого для приготовления исходной суспензии, или количество, кратное 90 см (для нежидких продуктов см. 9.1.2).

6.5 Пробирки (колбы или флаконы) вместимостью, достаточной для того, чтобы поместить и оставить сверху пространство, необходимое для перемешивания 10 см (или количества, кратного 10 см) пробы жидкого продукта или исходной суспензии, или дальнейших десятикратных разведений.

6.6 Пипетки мерные вместимостью 1 и 2 см, имеющие выпускное отверстие диаметром от 2 до 3 мм, закрытые ватой.

6.7 Градуированные пипетки вместимостью от 10 до 20 см, закрытые ватой.

6.8 рН-метр с погрешностью измерения ±0,1 рН.

6.9 Весы аналитические с точностью взвешивания до 0,01 г.

Примечание - Допускается использовать другое оборудование с такими же или более высокими метрологическими характеристиками. Стеклянная посуда должна быть пригодной к повторной стерилизации и быть химически инертной.

7 Отбор проб

7.1 Отбор проб - по ГОСТ 13496.0 .

8 Подготовка испытуемых проб

8.1 Подготовка испытуемых проб - по ГОСТ Р 51419 .

9 Порядок проведения разведений

9.1 Испытуемая проба и исходная суспензия (первичное разведение)

Методику, описанную в 9.1.1, используют в следующих случаях:

- для невязких жидких продуктов (вода, молоко и т.д.), в которых распределение микроорганизмов гомогенное или легко делается гомогенным механическим путем (встряхивание и т.д.);

- для жидкой части гетерогенной смеси, которая считается достаточно представительной для всей пробы (например, водная фаза животных или растительных жиров).

Для всех других продуктов используют методику, описанную в 9.1.2.

Чтобы избежать повреждения микроорганизмов в результате внезапных изменений температуры, температура разбавителя в течение всего испытания должна быть приблизительно такой же, как у испытуемой пробы.

9.1.1 Жидкие продукты (которые можно отбирать пипетками)

Встряхивают испытуемую пробу в руке, производя 25 движений вверх и вниз с амплитудой около 30 см за 7 с. Чтобы добиться равномерного распределения микроорганизмов, лучше использовать стандартное механическое устройство. Пипеткой отбирают 1 см исследуемой пробы и вносят его в 9 см разбавителя, избегая контакта пипетки с разбавителем.

Осторожно смешивают исследуемую порцию с разбавителем путем десятикратного втягивания другой пипеткой или в механическом смесителе в течение 5-10 с. Частоту вращения смесителя надо подбирать так, чтобы жидкость, которая образует воронку, не доходила до края сосуда на 2-3 см.

Примечание - Если известно, что для исследуемых продуктов скопления микроорганизмов более эффективно диспергируются механическим перемешиванием, чем пипеткой, и при этом получаются значительно отличающиеся результаты, то специальный стандарт, касающийся изучаемого продукта, должен рекомендовать только один из этих методов, в основном, с использованием механического перемешивания. Условия использования смесителя должны быть точно указаны.

9.1.2 Другие продукты

Взвешивают навеску испытуемой пробы массой (10±0,01) г или массой, кратной 10 г, в резервуаре вращательного встряхивателя или в пластиковой емкости стомахера вместимостью, достаточной для выполнения исследования и приготовления всех дальнейших разведений, требуемых специальным стандартом для исследуемого продукта.

Добавляют объем разбавителя, равный 9 см или кратный 9 см.

Вращательный встряхиватель используют в течение времени, достаточного для того, чтобы получить от 15000 до 20000 оборотов, но не более 2,5 мин.

Стомахер используют в течение 1-2 мин с учетом свойств продукта (см. примечание 2).

Дают осесть крупным частицам в течение 15 мин, затем переносят определенное количество с верхнего слоя суспензии в культуральную пробирку, колбу или флакон, используя большую пипетку. Если имеется слой жира, пробу отбирают из водного слоя. Это количество должно быть достаточным для выполнения всего исследования и приготовления дальнейших разведений. Если дня инокуляции или дальнейшего разведения из исходной суспензии необходимо отобрать только одну порцию, то этот перенос можно не делать.

Примечания

1 Для некоторых продуктов (например, для продуктов с острыми частицами или с компонентами, которые трудно измельчить) стомахер не пригоден. Его следует использовать только тогда, когда имеются доказательства (опубликованные данные или сравнительные тесты), что полученные результаты несущественно отличаются от результатов, полученных с использованием вращательного встряхивателя.

2 Следует учитывать тот факт, что для некоторых продуктов, в частности зерновых, данная выше продолжительность встряхивания не подходит для таких микроорганизмов, как дрожжи и плесень.

3 В этом случае стомахер дает более высокие выходы, чем вращательный встряхиватель. Стомахер следует использовать в течение 10 мин и избегать разделения, так как некоторые дрожжи и плесени могут теряться из надосадочной жидкости.

9.2 Дальнейшие десятикратные разведения

В случае исследования на наличие или отсутствие микроорганизмов в 0,1 см или 0,1 г продукта готовят следующие разведения.

Переносят чистой пипеткой (если смесь исходной суспензии была получена пипеткой, используют ту же пипетку) 1 см исходной суспензии (первичное 1+9 (10) разведение в другую пробирку, содержащую 9 см стерильного разбавителя, избегая контакта пипетки с разбавителем.

Тщательно перемешивают или путем десятикратного втягивания чистой пипеткой, или в механическом смесителе в течение 5-10 с, чтобы получить разведение 10. Частоту вращения смесителя подбирают так, чтобы жидкость во время образования воронки не доходила до краев сосуда на 2-3 см.

При необходимости повторяют эти операции, используя разведение 10 или дальнейшие разведения, чтобы получить разведения 10, 10 и т.д. до тех пор, пока не будет получено приемлемое число микроорганизмов.

9.3 Повторение отдельных процедур

Процедуры, описанные в 9.1 и 9.2, проводят такое число раз, которое установлено специальным стандартом для конкретного продукта.

Примечание - Статистически установлено, что для того, чтобы снизить разброс результатов при использовании метода подсчета колоний, следует повторить процедуры с различными порциями испытуемой пробы, а не удваивать число чашек, заселенных из каждой пробирки одной серии разведений.

9.4 Длительность процедуры

Обычно разведения готовят из испытуемой пробы непосредственно перед анализом; длительность процедуры приготовления разведений и использования их для инокуляции культуральной среды должна быть не более 30 мин.

Примечание - Для некоторых продуктов при приготовлении исходной суспензии необходимо соблюдать меры предосторожности, установленные специальным стандартом для конкретного продукта, например:

- использовать для получения суспензии повышенные температуры;

- регулировать рН пробы;

- восстанавливать обезвоженные продукты и оживлять микроорганизмы, поврежденные во время различных обработок и хранения продукта.

ПРИЛОЖЕНИЕ А (справочное). Библиография

ПРИЛОЖЕНИЕ А
(справочное)

ИСО 6497 Корма для животных. Методы отбора проб


ОКС 65.120 С19 ОКСТУ 9209, 9709

Ключевые слова: разведение, разбавитель, стерилизация, исходная суспензия, десятичные разведения, культуральная среда, инокуляция
__________________________________________________________________________________



Электронный текст документа
подготовлен АО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
Комбикорма. Часть 8. Корма животного и
растительного происхождения.
Методы анализа: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2002