Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Введение
Световая микроскопия
Электронная микроскопия
Поляризационная микроскопия
Приложение 1
Световая микроскопия
Световая микроскопия - это самый древний и в тоже время один из распространенных методов исследования и изучения растительной и животной клетки. Предполагается, что начало изучения клетки было именно с изобретением светового оптического микроскопа. Главная характеристика светового микроскопа - это разрешение светового микроскопа, определяемое длиной световой волны. Предел разрешения светового микроскопа определяется длиной световой волны, оптический микроскоп используется для изучения структур, которые имеют минимальные размеры равные длине волны светового излучения. Многие составляющие клетки близки по своей оптической плотности и требуют предварительной обработки перед микрокопированием, в противном же случае они практически не видны в обычный световой микроскоп. Для того, чтобы сделать их видимыми, используют различные красители, обладающие определенной избирательностью. Используя избирательные красители, появляется возможность более подробно исследовать внутреннее строение клетки.
Например:
краситель гематоксилин окрашивает некоторые компоненты ядра в синий или фиолетовый цвет;
после обработки последовательно флороглюцином и затем соляной кислотой одревесневшие оболочки клеток становятся вишнево - красными;
краситель судан III окрашивает опробковевшие клеточные оболочки в розовый цвет;
слабый раствор йода в йодистом калии окрашивает крахмальные зерна в синий цвет».
При проведении микроскопических исследований большую часть тканей перед началом окраски фиксируют.
После фиксации клетки становятся проницаемыми для красителей, а структура клетки стабилизируется. Одним из наиболее распространенных фиксаторов в ботанике является этиловый спирт.
В ходе приготовления препарата для микрокопирования выполняют тонкие срезы на микротоме (приложение 1, рис.1). В этом приборе использован принцип хлеборезки. Для растительных тканей изготавливают чуть более толстые срезы, чем для животных, поскольку клетки растений относительно крупней. Толщина срезов растительных тканей для - 10 мкм - 20 мкм. Некоторые ткани слишком мягкие, чтобы из них сразу же можно было получить срезы. Поэтому после фиксации их заливают в расплавленный парафин или специальную смолу, которые пропитывают всю ткань. После охлаждения образуется твердый блок, который потом режется на микротоме. Это объясняется тем, что растительные клетки имеют прочные клеточные стенки, составляющие каркас ткани. Особенно прочны одревесневшие оболочки.
Пользуясь заливкой при приготовлении, срез возникает опасность нарушения структуры клетки, для предотвращения этого пользуются методом быстрого замораживания. При использовании этого метода обходятся обойтись без фиксации и заливки. Замороженную ткань режут на специальном микротоме - криотоме (приложение 1, рис. 2).
Замороженные срезы лучше сохраняют особенности естественной структуры. Однако их труднее готовить, а присутствие кристаллов льда нарушает некоторые детали.
фазово-контрастный (прилож. 1, рис. 3) и интерференционный микроскопы (прилож.1, рис.4) позволяют исследовать под микроскопом живые клетки с четким проявлением детали их строения. В этих микроскопах используют 2 пучка световых волн, которые взаимодействуют (налагаются) друг на друга, усиливая или уменьшая амплитуду волн, поступающих в глаз от разных компонентов клетки.
Световая микроскопия имеет несколько разновидностей.
Метод светлого поля и его разновидности
Метод светлого поля в проходящем свете используют при изучении прозрачных препаратов с включенными в них поглощающими свет частицами и деталями (тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов). В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив.
Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.
Метод светлого поля в отражённом свете применяется при исследовании непрозрачных отражающих свет объектов, например шлифов металлов или руд. Освещение препарата (от осветителя и полупрозрачного зеркала) производится сверху, через объектив, который одновременно играет и роль конденсора. В изображении, создаваемом в плоскости объективом совместно с тубусной линзой, структура препарата видна из-за различия в отражающей способности её элементов; на светлом поле выделяются также неоднородности, рассеивающие падающий на них свет.
Метод темного поля и его разновидности
Метод тёмного поля в проходящем свете используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции - т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.
Электронная микроскопия
Первый электронный микроскоп сконструировали в 1931 г. Кнолл и Руска в Германии. Лишь в 50-е годы были разработаны методы изготовления срезов, обладающих необходимыми качествами.
Сложности электронной микроскопии состоят в том, что для исследования биологических образцов необходима специальная обработка препаратов.
Первая трудность заключается в том, что электроны обладают очень ограниченной проникающей способностью, поэтому следует изготавливать ультратонкие срезы, толщиной 50 - 100 нм. Для того, чтобы получить столь тонкие срезы, ткани сперва пропитывают смолой: смола полимеризуется и формирует твердый пластмассовый блок. Затем с помощью острого стеклянного или алмазного ножа срезы нарезают на специальном микротоме.
Есть еще одна трудность: при прохождении через биологическую ткань электронов не получается контрастного изображения. Для того, чтобы получить контраст, тонкие срезы биологических образцов пропитывают солями тяжелых металлов.
Существует два основных типа электронных микроскопов. В трансмиссионном (просвечивающем) микроскопе пучок электронов, проходя сквозь специально подготовленный образец, оставляет его изображение на экране. Разрешающая способность современного трансмиссионного электронного микроскопа почти в 400 раз больше светового. Эти микроскопы имеют разрешающую способность около 0,5 нм.
Несмотря на столь высокое разрешение, просвечивающие электронные микроскопы имеют крупные недостатки:
приходится работать с фиксированными материалами;
изображение на экране получается двумерным (плоским);
при обработке тяжелыми металлами разрушаются и видоизменяются некоторые клеточные структуры.
Трехмерное (объемное) изображение получают с помощью сканирующего электронного микроскопа (ЭМ). Здесь луч не проходит через образец, а отражается от его поверхности.
Исследуемый образец фиксируют и высушивают, после чего покрывают тонким слоем металла операция называется оттенением (образец оттеняют).
В сканирующем ЭМ сфокусированный электронный пучок направляется на образец (образец сканируют). В результате металлическая поверхность образца испускает вторичные электроны слабой энергии. Они регистрируются и преобразуются в изображение на телевизионном экране. Максимальное разрешение сканирующего микроскопа невелико, около 10 нм, но зато изображение получается объемным.
Разновидности электронной микроскопии:
Амплитудная электронная микроскопия - Методы амплитудной электронной микроскопии могут быть использованы для обработки изображений аморфных и других тел (размеры частиц которых меньше разрешаемого в электронном микроскопе расстояния), рассеивающих электроны диффузно. В просвечивающем электронном микроскопе, например, контраст изображения, т. е. перепад яркостей изображения соседних участков объекта, в первом приближении пропорционален перепаду толщин этих участков.
Фазовая электронная микроскопия - Для расчёта контраста изображений кристаллических тел, имеющих регулярные структуры, а также для решения обратной задачи - расчёта структуры объекта по наблюдаемому изображению - применяются методы фазовой электронной микроскопии. Рассматривается задача о дифракции электронной волны на кристаллической решетке, при решении которой дополнительно учитываются неупругие взаимодействия электронов с объектом: рассеяние на плазмах, фононах и т. п. В просвечивающих электронных микроскопах и растровых просвечивающих электронных микроскопах высокого разрешения получают изображения отдельных молекул или атомов тяжелых элементов. Привлекая методы фазовой электронной микроскопии, можно восстанавливать по изображениям трехмерную структуру кристаллов и биологических макромолекул.
Количественная электронная микроскопия - Методы количественной электронной микроскопии - это точное измерение различных параметров образца или исследуемого процесса, например измерение локальных электрических потенциалов, магнитных полей, микрогеометрии поверхностного рельефа и т. д.
Лоренцова электронная микроскопия - Областью исследования Лоренцовой электронной микроскопии, в которой изучают явления, обусловленные силой Лоренца, являются внутренние магнитные и электрические поля или внешние поля рассеяния, например, поля магнитных доменов в тонких пленках, сегнетоэлектрических доменов, поля головок для магнитной записи информации и т. п.
Поляризационная микроскопия
Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.
Метод фазового контраста
Метод фазового контраста и его разновидность - т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.
Типичная схема работы метода: в переднем фокусе конденсора устанавливается апертурная диафрагма, отверстие которой имеет форму кольца. Её изображение возникает вблизи заднего фокуса объектива, и там же устанавливается т. н. фазовая пластинка, на поверхности которой имеется кольцевой выступ или кольцевая канавка, называемая фазовым кольцом. Фазовая пластинка не всегда помещена в фокусе объектива - часто фазовое кольцо наносят прямо на поверхность одной из линз объектива.
В любом случае не отклонённые в препарате лучи от осветителя, дающие изображение диафрагмы, должны полностью проходить через фазовое кольцо, которое значительно ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на л/4 (л -- длина волны света). А лучи, даже ненамного отклоненные (рассеянные) в препарате, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо, и не претерпевают дополнительного сдвига фазы.
С учётом фазового сдвига в материале препарата полная разность фаз между отклоненными и не отклонёнными лучами близка к 0 или л/2, и в результате интерференции света в плоскости изображения препарата они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры препарата. Отклоненные лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению с не отклонёнными, поэтому ослабление основного пучка в фазовом кольце, сближая значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения.
Метод дает возможность различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабоконтрастные в методе светлого поля. Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам, рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе с не отклонёнными через фазовое кольцо. Для таких частиц фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.
Метод наблюдения в инфракрасных лучах
Метод наблюдения в инфракрасных (ИК) лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое с использованием фотографирования или с помощью электронно-оптического преобразователя. ИК микроскопия дает возможность изучать внутреннюю структуру тех объектов, которые непрозрачны в видимом свете, например тёмных стекол, некоторых кристаллов и минералов и пр
Метод наблюдения в ультрафиолетовых лучах
Метод наблюдения в ультрафиолетовых (УФ) лучах делает возможным увеличение предельной разрешающей способности микроскопа. Главное преимущество метода состоит в том, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Характерными спектрами поглощения в УФ области обладают многие вещества, содержащиеся в растительных и животных клетках (пуриновые основания, пиримидиновые основания, большинство витаминов, ароматические аминокислоты, некоторые липиды, тироксин и др.).
Так как ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза, то изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически, либо с помощью электронно-оптического преобразователя или люминесцирующего экрана. Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра. Каждый из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (например, синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. Результат - цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.
Микрофотографирование и микрокиносъёмка - это получение с помощью микроскопа изображений на светочувствительных слоях. Данный метод широко применяется совместно со всеми другими методами микроскопического исследования. Для микрофото- и микрокиносъёмки требуется некоторая перестройка оптической системы микроскопа -- иная по сравнению с визуальным наблюдением фокусировки окуляра относительно изображения, даваемого объективом. Микрофотография необходима при документировании исследований, при изучении объектов в невидимых для глаза УФ и ИК лучах (см. выше), а также объектов со слабой интенсивностью свечения. Микрокиносъёмка незаменима при исследовании процессов, развёртывающихся во времени (жизнедеятельности тканевых клеток и микроорганизмов, роста кристаллов, протекания простейших химических реакций и т. п.).
Метод интерференционного контраста
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Конденсор и объектив снабжены двояко-преломляющими пластинками, из которых первая расщепляет исходный световой луч на два луча, а вторая воссоединяет их. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. Этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Этот метод пригоден для изучения живых тканей и клеток и применяется во многих случаях именно с этой целью. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта.
Метод исследования в свете люминесценции
Метод исследования в свете люминесценции состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном не люминесцирующем фоне.
Метод реплик
Метод реплик используют для изучения поверхностной геометрической структуры массивных тел. С поверхности такого тела снимается отпечаток в виде тонкой плёнки углерода, коллодия, формвара и др., повторяющий рельеф поверхности и рассматривается в просвечивающем электронном микроскопе. Обычно предварительно под скользящим (малым к поверхности) углом на реплику в вакууме напыляется слой сильно рассеивающего электроны тяжёлого металла, оттеняющего выступы и впадины геометрического рельефа.
Метод декорирования
Метод декорирования исследует не только геометрическую структуру поверхностей, но и микрополя, обусловленные наличием дислокаций, скопления точечных дефектов, ступени роста кристаллических граней, доменную структуру и т. д. Согласно этому методу, на поверхность образца вначале напыляется очень тонкий слой декорирующих частиц (атомы Au, Pt и др., молекулы полупроводников или диэлектриков), осаждающихся преимущественно на участках сосредоточения микрополей, а затем снимается реплика с включениями декорирующих частиц.
Для получения клеточных фракций широко применяются различные виды центрифугирования: дифференциальное центрифугирование, зональное центрифугирование и равновесное центрифугирование в градиенте плотности. Теоретические и практические вопросы, связанные с центрифугированием, всесторонне разобраны в обзоре Сайкса.
Дифференциальное центрифугирование
В случае дифференциального центрифугирования образцы центрифугируют определенное время при заданной скорости, после чего удаляют надосадочную жидкость. Этот метод полезен для разделения частиц, сильно различающихся по скорости седиментации. Например, центрифугирование в течение 5--10 мин при 3000-- 5000 д приводит к осаждению интактных бактериальных клеток, тогда как большинство клеточных фрагментов при этом остается в надосадочной жидкости. Фрагменты клеточной стенки и большие мембранные структуры можно осадить центрифугированием при 20 000--50 000 § в течение 20 мин, в то время как маленькие мембранные везикулы и рибосомы требуют для осаждения центрифугирования при 200 000 § в течение 1 ч.
Зональное центрифугирование
Зональное центрифугирование представляет собой эффективный способ разделения структур, имеющих сходную плавучую плотность, но различающихся по форме и массе частиц. В качестве примеров можно привести разделение субъединиц рибосом, различных классов полисом, а также молекул ДНК, имеющих различную форму. Центрифугирование осуществляют либо в бакет-роторах, либо в специально устроенных зональных роторах; для предотвращения конвекции при центрифугировании в стаканах бакет-ротора или в камере зонального ротора создают слабый градиент (обычно сахарозы). Пробу наносят в виде зоны или узкой полосы в самом верху градиентного столбика. Для субклеточных частиц обычно используется градиент сахарозы от 15 до 40% (вес/объем).
Метод Лауэ
применяется для монокристаллов. Образец облучается пучком с непрерывным спектром, взаимная ориентация пучка и кристалла не меняется. Угловое распределение дифрагированного излучения имеет вид отдельных дифракционных пятен (лауэграмма).
Метод Дебая-Шеррера
Используется для исследования поликристаллов и их смесей. Хаотическая ориентация кристаллов в образце относительно падающего монохроматического пучка превращает дифрагированные пучки в семейство коаксиальных конусов с падающим пучком на оси. Их изображение на фотоплёнке (дебаеграмма) имеет вид концентрических колец, расположение и интенсивность которых позволяет судить о составе исследуемого вещества.
Метод клеточных культур
Некоторые ткани удается разделить на отдельные клетки так, что клетки при этом остаются живыми и часто способны к размножению. Этот факт окончательно подтверждает представление о клетке как единице живого. Губку, примитивный многоклеточный организм, можно разделить на клетки путем протирания сквозь сито. Через некоторое время эти клетки вновь соединяются и образуют губку. Эмбриональные ткани животных можно заставить диссоциировать с помощью ферментов или другими способами, ослабляющими связи между клетками.
Американский эмбриолог Р. Гаррисон (1879-1959) первым показал, что эмбриональные и даже некоторые зрелые клетки могут расти и размножаться вне тела в подходящей среде. Эта техника, называемая культивированием клеток, была доведена до совершенства французским биологом А.Каррелем (1873-1959). Растительные клетки тоже можно выращивать в культуре, однако по сравнению с животными клетками они образуют большие скопления и прочнее прикрепляются друг к другу, поэтому в процессе роста культуры образуются ткани, а не отдельные клетки. В клеточной культуре из отдельной клетки можно вырастить целое взрослое растение, например морковь.
Метод микрофигурии
С помощью микроманипулятора отдельные части клетки можно удалять, добавлять или каким-то образом видоизменять. Крупную клетку амебы удается разделить на три основных компонента - клеточную мембрану, цитоплазму и ядро, а затем эти компоненты можно вновь собрать и получить живую клетку. Таким путем могут быть получены искусственные клетки, состоящие из компонентов разных видов амеб.
Если принять во внимание, что некоторые клеточные компоненты представляется возможным синтезировать искусственно, то опыты по сборке искусственных клеток могут оказаться первым шагом на пути к созданию в лабораторных условиях новых форм жизни. Поскольку каждый организм развивается из одной единственной клетки, метод получения искусственных клеток в принципе позволяет конструировать организмы заданного типа, если при этом использовать компоненты, несколько отличающиеся от тех, которые имеются у ныне существующих клеток. В действительности, однако, полного синтеза всех клеточных компонентов не требуется. Структура большинства, если не всех компонентов клетки, определяется нуклеиновыми кислотами. Таким образом, проблема создания новых организмов сводится к синтезу новых типов нуклеиновых кислот и замене ими природных нуклеиновых кислот в определенных клетках.
Метод слияния клеток
Другой тип искусственных клеток может быть получен в результате слияния клеток одного или разных видов. Чтобы добиться слияния, клетки подвергают воздействию вирусных ферментов; при этом наружные поверхности двух клеток склеиваются вместе, а мембрана между ними разрушается, и образуется клетка, в которой два набора хромосом заключены в одном ядре. Можно слить клетки разных типов или на разных стадиях деления. Используя этот метод, удалось получить гибридные клетки мыши и цыпленка, человека и мыши, человека и жабы. Такие клетки являются гибридными лишь изначально, а после многочисленных клеточных делений теряют большинство хромосом либо одного, либо другого вида. Конечный продукт становится, например, по существу клеткой мыши, где человеческие гены отсутствуют или имеются лишь в незначительном количестве. Особый интерес представляет слияние нормальных и злокачественных клеток. В некоторых случаях гибриды становятся злокачественными, в других нет, т.е. оба свойства могут проявляться и как доминантные, и как рецессивные. Этот результат не является неожиданным, так как злокачественность может вызываться различными факторами и имеет сложный механизм.
клетка микроскопия световой
Приложение 1
Рисунок 2. Криотом Рисунок 3. Фазово-контрастный микроскоп
Рисунок 4. Интерференционный микроскоп
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Изучение строения и принципов работы светового и электронного микроскопов. Рассмотрение методов темного и светлого поля, фазово-контрастной микроскопии, интерференции и поляризации. Витальное фиксированное изучение клеток. Основы электронной микроскопии.
лекция , добавлен 16.05.2014
Сканирующий туннельный микроскоп, применение. Принцип действия атомного силового микроскопа. Исследование биологических объектов – макромолекул (в том числе и молекул ДНК), вирусов и других биологических структур методом атомно-силовой микроскопии.
курсовая работа , добавлен 28.04.2014
Понятие электронной микроскопии как совокупности методов исследования с помощью электронных микроскопов микроструктур тел, их локального состава. Содержание телевизионного принципа развертки тонкого пучка электронов или ионов по поверхности образца.
презентация , добавлен 22.08.2015
Измерение размеров малых объектов. Метод фазового контраста. Понятие об электронной оптике. Создание электронного микроскопа. Опыты по дифракции электронов. Исследования поверхностной геометрической структуры клеток, вирусов и других микрообъектов.
презентация , добавлен 12.05.2017
Электронно-микроскопический метод исследования. Физические основы растровой электронной микроскопии. Схема растрового электронного микроскопа, назначение его узлов и их функционирование. Подготовка объектов для исследований и особые требования к ним.
курсовая работа , добавлен 04.05.2011
Оптический диапазон спектра. Теоретические основы оптических методов НК. Световые колебания. Классификация оптических методов НК. Дискретный спектр излучения газов и жидкостей. Непрерывный спектр собственного излучения твёрдых тел с разной температурой.
реферат , добавлен 15.01.2009
Общая характеристика методов, применяемых для измерения параметров капилляров фильер: голографической интерферометрии, Фурье-оптики, микроскопический. Сравнительный анализ рассмотренных методов, определение их основных преимуществ и недостатков.
контрольная работа , добавлен 20.05.2013
Создание атомного силового микроскопа, принцип действия, преимущества и недостатки. Методы атомно-силовой микроскопии. Технические возможности атомного силового микроскопа. Применение атомно-силовой микроскопии для описания деформаций полимерных пленок.
курсовая работа , добавлен 14.11.2012
История микроскопа - прибора для получения увеличенного изображения объектов, не видимых невооруженным глазом. Методы световой микроскопии. Принцип действия и устройство металлографического микроскопа. Методы микроскопического исследования металлов.
реферат , добавлен 10.06.2009
Основы сканирующей электронной микроскопии. Методические особенности электронно-микроскопического исследования металлических расплавов. Особенности микроскопов, предназначенных для исследования структуры поверхностных слоев металлических расплавов.
Е. Темнопольная микроскопия.
18. Микроскоп состоит из оптических и механических частей. Что относят к оптическим частям?
А. Тубус, окуляр, конденсор
В. Револьвер, макро- и микровинт, зеркало
С. Револьвер, окуляр
Д. Окуляр, конденсор, объектив
Е. Тубус, окуляр, револьвер
19. При использовании ультрафиолетовых лучей, как источник света, разрешающая способность микроскопа увеличивается. В каких микроскопических приборах используется данный источник света?
А. Темнопольный и люминесцентный
В.Люминесцентный, ультрафиолетовый
С. Световой и электронный
Д.Фазово-контрастный, ультрафиолетовый
Е.Поляризационный, ультрафиолетовый
20. Микроскоп состоит из механических и оптических частей. В каких деталях микроскопа есть диафрагма?
А. Окуляр и объектив
В. Окуляр и конденсор
С. Тубус и окуляр
Д. Объектив и конденсор
Е. Тубус, объектив, окуляр
21. В эксперименте использовались живые объекты, в которых необходимо определить ряд химических компонентов, используя витальное наблюдение. Какой микроскопический метод исследования будет использован?
А. Фазово-контрастная микроскопия
В. Электронная микроскопия
С. Флюоресцентная микроскопия
Е Темнопольная микроскопия.
22. При гистологическом исследовании клетки использовали люминофоры. Какой вид микроскопии использован в данном случае?
А. Световая микроскопия
В. Электронная микроскопия
С. Флюоресцентная микроскопия
Д. Поляризационная микроскопия
Е. Темнопольная микроскопия.
23. Перед исследователем поставлена задача получить пространственное представление о структурах изучаемого объекта. С каким микроскопическим прибором будет работать специалист?
А. Ультрафиолетовая микроскопия,
В. Фазово-контрастная микроскопия,
С. Просвечивающая электронная микроскопия,
Д. Сканирующая электронная микроскопия,
Е. Поляризационная микроскопия
24. В качестве источника света используются ртутно-кварцевые лампы. Какова разрешающая способность микроскопа при таком источнике света?
25. Разрешающая способность микроскопа зависит от длины волны источника света. Какова разрешающая способность светового микроскопа?
26. Перед началом исследования гистологического препарата необходимо равномерно осветить поле зрения. Какие части микроскопа для этого используют?
А. Микро- и макровит
В. Конденсор и зеркало
С. Тубус и тубусодержатель
Д. Тубус и окуляр
27. Перед исследователем поставлена задача изучить ультра-микроскопическое строение плазмолеммы эритроцита. Какой микроскопический прибор будет использован?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрафиолетовый
28. При изучении скелетной мышечной ткани необходимо определить изо- и анизотропные структуры ткани. Какой вид микроскопии будет использован?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрамикроскопический
29. Разрешающая способность люминесцентного микроскопа зависит от длины волны источника света. Чему она равна?
А. 0,1 мкм С. 0,4 мкм
В. 0,2 мкм Д. 0,1 нм
30. В клинической лаборатории для изучения общего анализа крови используются микроскопические исследования. Какой микроскоп необходим для этого?
А. Световой,
В. Фазово-контрастный,
С. Электронный,
Д. Поляризационный,
Е. Ультрафиолетовый.
31. Для исследования представлен живой объект, обладающий природной люминесценцией. Какой вид микроскопии необходимо использовать при данном исследовании?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрафиолетовый
32. В результате биопсии получен материал опухолевых клеток. Необходимо изучить их ультрамикроскопическое строение. Какой вид микроскопии используют при данном исследовании?
А. Световой
В. Фазово-контрастный
С. Электронный
Д. Поляризационный
Е. Ультрафиолетовый
ТЕМА 2: ГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА
Основные принципы приготовления препаратов для световой и электронной микроскопии, взятие материала (биопсия, игловая пункционная биопсия, аутопсия). Фиксация, обезвоживание, уплотнение объектов, приготовление срезов на микротомах и ультрамикротомах. Виды мипрепаратов - срез, мазок, отпечаток, пленки, шлиф. Окрашивание и контрастирование препаратов. Понятие о гистологических красителях.
Микроскопическая техника.
Главные этапы цитологического и гистологического анализа:
Выбор объекта исследования
Подготовка его для изучения в микроскопе
Применение методов микроскопирования
Качественный и количественный анализ полученных изображений
Методы, применяемые в гистологической технике:
1. Прижизненные.
2. Посмертные.
I ПРИЖИЗНЕННЫЕ МЕТОДЫ
Целью прижизненных исследований является получение информации о жизнедеятельности клетки: движение, деление, рост, дифференцировка, взаимодействие клеток, продолжительность жизни, разрушение, реактивные изменения под действием различных факторов.
Исследование живых клеток и тканей возможно вне организма (in vitro) или внутри организма (in vivo).
А. Исследование живых клеток и тканей в культуре (in vitro) –
Метод культивирования
Различают: а)суспензионные культуры (клетки, взвешенные в питательной среде), б)тканевые, в)органные, г)монослойные.
Метод культивирования ткани вне организма является самым распространенным. Культивировать ткань можно в специальных прозрачных герметически закрытых камерах. В стерильных условиях в камеру помещают каплю питательной среды. Наилучшей питательной средой является плазма крови, к которой добавляют эмбриональный экстракт (вытяжка из тканей зародыша, содержащая большое количество веществ, стимулирующих рост). Туда же помещают кусочек органа или ткани (не более 1 мм3), которые необходимо культивировать.
Выдерживать культивируемую ткань следует при температуре тела организма, ткань которого взята для исследования. Так как питательная среда быстро приходит в негодность (в ней накапливаются продукты распада, выделяемые культивируемой тканью), то каждые 3-5 дней ее нужно менять.
Использование метода культивирования позволило выявить ряд закономерностей дифференцировки, злокачественного перерождения клеток, взаимодействий клеток между собой, а также с вирусами и микробами. Культивирование эмбриональных тканей позволило изучить развитие кости, хряща, кожи и др.
Особую значимость метод культивирования имеет для проведения экспериментальных наблюдений на клетках и тканях человека, в частности для определения пола, злокачественного перерождения, наследственных заболеваний и др.
Недостатки метода:
1. Главным недостатком этого метода является то, что ткань либо орган исследуется в отрыве от организма. Не испытывая нейрогуморального влияния организма, она теряет присущую ей дифференцировку.
2. Необходимость частых пересадок (при длительном культивировании).
3. Одинаковый коэффициент лучепреломления тканей.
Похожая информация.
Гистологическое исследование - это исследование тканей под микроскопом. А цитологическое исследование отличается от гистологического тем, что при нём проводится не исследование ткани, а исследование клеток.
Виды микроскопии
Методы световой микроскопии
Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения). Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.
Метод светлого поля и его разновидности
Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д.
Метод темного поля и его разновидности
Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры не окрашенного материала. При этом лучи от осветителя падают на препарат под косым углом, и объект исследования проявляется освещенным в темном поле..
Метод фазового контраста
При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные — фаза световой волны, что и используют для получения высоко контрастного изображения.
Поляризационная микроскопия
Поляризационная микроскопия позволяет изучать ультраструктурную организацию тканевых компонентов на основе анализа анизотропии и/или двойного лучепреломления
Метод интерференционного контраста
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой - мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором
Метод исследования в свете люминесценции
Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами.
Ультрафиолетовая микроскопия . Основана на применении ультрафиолетовых лучей с длиной волны менее 380 нм, что позволяет увеличить разрешающую способность объективов с 0,2…0,3 мкм до 0,11 мкм. Требует применения специальных ультрафиолетовых микроскопов, в которых используются ультрафиолетовые осветители, кварцевая оптика и преобразователи ультрафиолетовых лучей в видимую часть спектра. Многие вещества, входящие в состав клеток (например, нуклеиновые кислоты), избирательно поглощают ультрафиолетовые лучи, что используется для определения количества этих веществ в клетке.
Трансмиссионная микроскопия . В трансмиссионных микроскопах электроны проходят через образец. Энергия электронов сравнительно невелика (до 50 кВ); при этом происходит их рассеивание и поглощение. Для создания контрастного изображения применяются особые методы подготовки материала.
Сканирующие электронные микроскопы основаны на сканировании образца. При этом точно сфокусированный пучок электронов пробегает по поверхности образца, а отраженные электроны формируют изображение, подобное трехмерному. Разрешающая способность сканирующего микроскопа меньше, чем у трансмиссионного (5…20 нм).
Высоковольтные электронные микроскопы основаны на использовании электронов сверхвысоких энергий (до 1 МВ – одного миллиона вольт). Столь мощные пучки пробивают относительно толстые срезы (до 5 мкм), что позволяет использовать этот тип микроскопии для изучения целостных клеток.
Метод замораживания – скалывания.
Клетки замораживают при температуре жидкого азота (196 О С) в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнажённую внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем ЭМ. Затем, обычно в вакуумной камере, избыток льда удаляют возгонкой. Эта операция называется травлением. После травления более резко обозначается рельеф в плоскости скола. Полученный образец оттеняется, то есть на поверхность образца напыляется тонкий слой тяжелых металлов.
Культура тканей, микрургия.
Метод культуры клеток и тканей
заключается в выращивании клеток и тканей вне организма в искусственных питательных средах. Метод позволяет изучать реакции клеток на различные воздействия, механизмы регуляции пролиферации, дифференцировки и гибели.
Микрургия (micrurgia; микр + ergon - работа, действие) - совокупность методических приемов и технических средств для осуществления операций на очень мелких объектах: одноклеточных организмах, отдельных клетках многоклеточных, внутриклеточных структурах.
Клеточная инженерия, понятие о гетерокарионе, гибридизация.
Гетерокарион — соматическая клетка, образованная в результате слияния родительских клеток с гаплоидными генетически различными ядрами. Образовавшиеся гетерокарионы дают начало двум одноядерным гибридным клеткам.
В 1965 году английский ученый Г. Харрис впервые получил гетерокарионы, образованные клетками мыши и человека.
Гибридизация- процесс образования или получения гибридов , в основе которого лежит объединение генетического материала разных клеток в одной клетке
Метод фазово-контрастной микроскопии
Большая часть клеточных структур мало отличается коэффициентом преломления света, поглощения лучей друг от друга и среды. Для того, чтобы изучить такие компоненты приходится изменять освещенность(с потерей четкости изображения) или применять особые методы и приборы. Метод фазово-контрастной микроскопии является одним из таких. Его широко применяют при витальном изучении клеток. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе. Невидимые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости, которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. В получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным. Объекты могут выглядеть темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).
Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия)
Метод интерференционного контраста сходен с предыдущим - они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Пучок параллельных световых лучей от осветителя раздваивается на два потока, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу и приобретает изменения в фазе колебания, другой -- мимо минуя объект по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции будет строиться изображение, на котором участки клетки, обладающие разной толщиной или разной плотностью, будут отличаться друг от друга по степени контрастности. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта.
Поляризационная микроскопия
Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете за объектами, обладающими изотропией, т.е. упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц. Перед конденсором поляризационного микроскопа помещается поляризатор, который пропускает световые волны с определенной плоскостью поляризации. После препарата и объектива помещается анализатор, который может пропускать свет с этой же плоскостью поляризации. Если анализатор повернуть затем на 90о по отношению к первой, то свет проходить не будет. В том случае, когда между такими скрещенными призмами будет находиться объект, обладающий способностью поляризовать свет, он будет виден как светящийся на темном поле. С помощью поляризационного микроскопа можно убедиться, например, в ориентированном расположении мицелл в клеточной стенке растений.
Поляризационная микроскопия является одним из мощных методов морфологических исследования структуры и свойств препаратов. Поляризационная микроскопия позволяет изучать свойства гистологических структур, обладающих способностью двойного лучепреломления.
Для реализации метода поляризационной микроскопии можно дооснастить любой микроскоп. Микроскоп дооснащяется двумя поляризационными фильтрами: первый помещают непосредственно под конденсором, второй помещают между объективом и глазом исследователя. Поворотом поляризатора добиваются затемнения поля зрения. Помещают препарат. Вращают препарат на предметном столике до появления ярко светящихся структур. Свечение появляется в тот момент, когда ось двулучепреломляющего объекта будет находиться под углом 45° к плоскости поляризации.
Ранее для поляризационной микроскопии использовались поляризационные фильтры с линейной поляризацией. В новой методике изучалась возможности диагностики препаратов с использованием поляризационных фильтров с циркулярной поляризацией. Оказалось, что изображения, полученные с помощью циркулярных фильтров, несут гораздо больше информации и позволяют выявлять более тонкую структуру тканей и клеток.
Исследования в поляризованном свете можно проводить на замороженных или парафиновых срезах после депарафинизации, неокрашенных и окрашенных, заключенных в различные среды. Блоки ткани следует вырезать и ориентировать таким образом, чтобы мышечные волокна интересующего слоя миокарда были срезаны продольно.
Миофибриллы в поляризованном свете обнаруживают характерную поперечную исчерченность, связанную с чередованием, анизотропных (А) и изотропных I - дисков. Диски А обладают ярко выраженным положительным двулучепреломлением и кажутся светлыми в поляризованном свете (в обычном свете они темные), тогда как I - диски почти полностью лишены способности к двулучепреломлению и в поляризованном свете выглядят темными (в обычном свете - светлые).
С помощью поляризационной микроскопии удобно выявлять наиболее универсальные повреждения мышечных волокон миокарда и скелетных мышц - контрактурные повреждения (нарушение поперечной исчерченности кардиомиоцитов - одно из ранних признаков повреждения миофибрилл).
Принято выделять 3 стадии этих повреждений:
I стадия - усиливается анизотропия на отдельных участках мышечных волокон. II
стадия - А-диски с повышенной анизотропией сближаются, вследствие чего толщина 1-дисков уменьшается. III
стадия - А-диски сливаются в сплошной анизотропный конгломерат.
Наряду с контрактурными повреждениями поляризационная микроскопия
позволяет идентифицировать еще один тип поражения поперечнополосатых мышечных волокон - гиперрелаксацию саркомеров, свойственную в большой мере ишемии миокарда .
Простота поляризационного метода позволяет с минимальными затратами резко повысить достоверность диагностики наличия инфаркта миокарда.
По поводу поляризационного микроскопа. Ситуация состоит в том, что практически из любого микроскопа можно сделать поляризационный. Используются два поляризационных фильтра (покупаемых в фотомагазине) - один помещается над осветителем, а второй помещается между препаратом и объективом.
Создан справочный CD-ROM - «Поляризационная микроскопия». На диске собрано большое количество работ и материалов по применению поляризационной микроскопии.
Кроме того, создан специализированный комплекс - автоматизированное рабочее место судмедэксперта. В состав комплекса входят - микроскоп поляризационный Nikon E200, цифровая камера с 8 млн элементов, адаптеры и программное обеспечение.
Список литературы: 1.
Кактурский Л.В. Поляризационная микроскопия. В кн. Микроскопическая техника. - М.: Медицина, 1996. 2.
Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А. Применение поляризационной микроскопии для гистологической диагностики ранних стадий ишемических и метаболических повреждений миокарда // Cor et vasa. - 1977 - Vol. 19. - № 1. - P. 28-33 3.
Непомнящих Л.М. Морфогенез важнейших общепатологических процессов в сердце. - Новосибирск: Наука, 1991. - 352 с. 4.
Целлариус Ю.Г., Семенова Л.А., Непомнящих Л.М. Очаговые повреждения и инфаркт миокарда. Световая, поляризационная и электронная микроскопия. - Новосибирск, 1980.
Еще по теме Колтовой Н.А. НОВЫЙ МЕТОД ПОЛЯРИЗАЦИОННОЙ МИКРОСКОПИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ИНФАРКТА МИОКАРДА:
- ВОПРОС 252: Какие недостатки в профессиональной деятельности медицинских работников могут стать поводом для возбуждения уголовного или гражданского дела?
- Кирилов В.А., Бахметьев В.И. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОРФОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИДА ВНЕШНЕГО ВОЗДЕЙСТВИЯ ПО МОРФОЛОГИЧЕСКИМ ПРИЗНАКАМ РАЗРУШЕНИЯ ДЛИННЫХ ТРУБЧАТЫХ КОСТЕЙ
- Мишин Е.С., Подпоринова Е.Э., Праводелова А.О. ОЦЕНКА МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ПОДЪЯЗЫЧНОЙ КОСТИ, ГОРТАНИ И ТРАХЕИ ПРИ ТУПОЙ ТРАВМЕ ШЕИ
